尼罗罗非鱼t细胞激活相关基因的功能研究

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1、分类号:Q786密级：公开UDC：577学号：2111201U3r海洋太f硕士学位论文尼罗罗非鱼T细胞激活相关基因的功能研究甘桢指导教师：鲁义善教授串请学位类别：农学硕士专业名称：水产养殖研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制学院名称：水产学院—中国•湛江2015年6月、、、.’(、機齡:入嗲像铪夂答辨奏炎会极祆主席：^•导师：暴碌时间：24寻$料0学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其它个人或集体已经发表或撰与的成果作

2、品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名：20/f年g月;日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密□，在______年解密后适用本授权书。2、不保密B。(请在以上相应方框内打“V”

3、）作者签名:导师签名:尼罗罗非鱼T细胞激活相关基因的功能研究摘要罗非鱼是一种在全世界广泛养殖的经济鱼类，近年来，以链球菌病为代表的罗非鱼病害频繁发生，给罗非鱼产业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了该产业的健康发展。由于其较高的经济价值，对罗非鱼病害的研究逐渐成为水产动物病害防治领域的研究热点，而由无乳链球菌引起的链球菌病是其中一个主要的研究方向。然而，目前关于罗非鱼的T细胞，特别是关于T细胞激活方面的研究还十分有限。CD59、CD2BP2和Lck是三种与共刺激分子CD2存在互作的关键蛋白分子，在CD2介导的T细胞激活中起到着至关重

4、要的作用。为了解罗非鱼T细胞对胞内寄生菌的免疫应答机制，本研究以尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）为研究对象，克隆了尼罗罗非鱼CD59、CD2BP2和Lck的cDNA序列全长，并对其组织分布、对无乳链球菌刺激的免疫应答以及功能特征进行了初步的研究。CD59是一种重要的补体抑制蛋白和T细胞调节蛋白，在非特异性免疫应答和特异性免疫应答中都发挥着重要的作用。在本研究中，尼罗罗非鱼的CD59基因（简称为On-CD59）被成功克隆，序列分析结果表明On-CD59的cDNA全长为1176bp，包含一段长为74bp的5'端

5、非编码区、一段长为748bp的3'端非编码区以及一段长为354bp、编码117个氨基酸的开放式阅读框（ORF）。On-CD59所推测的氨基酸序列具有已知CD59分子所具有的五大特征结构，包括N端的信号肽、C端的GPI锚定区、中间的LU结构域、CCXXXXCN基序以及10个半胱氨酸残基。在健康的罗非鱼中，On-CD59mRNA的表达在本研究所检测的所有组织中都能被检测到，其中在脑的表达量远高于其他组织；在经灭活无乳链球菌刺激24h后，On-CD59mRNA在皮肤、大脑、头肾、胸腺和脾脏的表达都发生了显著的上调。此外，在灭活无乳链球

6、菌刺激后，On-CD59的表达在皮肤、脑、头肾、胸腺和脾脏表现出明显的时间依赖性表达模式，On-CD59在皮肤的表达水平于免疫12h后达到峰值，而在脑和头肾则是于免疫24h后达到峰值，在胸腺和脾脏到达峰值的时间最晚，为免疫48h后。补体抑制活性试验结果表明On-CD59不但具有补体抑制活性，而且这种活性具有物种选择性。而生物素-链霉亲和素ELISA以及集落形成单位试验结果则分别表明，On-CD59能结合革兰氏阳性菌细胞壁的主要组分PGN和LTA，并对无乳链球菌具有一定的抗菌活性。CD2BP2是几种与CD2胞质区结合的接头蛋白之一

7、，在CD2介导的T细胞激活以及核剪接中都起着关键的作用。在本研究中，尼罗罗非鱼的CD2BP2基因（简称为On-CD2BP2）被成功克隆，序列分析结果表明On-CD2BP2的cDNA全长为1429bp，包含一段长为111bp的5'端非编码区、一段长为193bp的3'端非编码区以及一段长I为1125bp、编码374个氨基酸的开放式阅读框。On-CD2BP2所推测的氨基酸序列具有已知CD2BP2分子所具有的两大特征结构，即C端的GYF结构域和GPFXXXXMXXWXXXGYF基序，且其所推测的基因结构与已知的CD2BP2分子十分相似。

8、在健康的罗非鱼中，On-CD2BP2mRNA在头肾、脾脏和肝脏的表达量较高；在经灭活无乳链球菌刺激48h后，On-CD2BP2mRNA在头肾、脾脏和脑的表达都发生了显著的上调。此外，在灭活无乳链球菌刺激后，On-CD2BP2在头肾、脾脏和脑的表达表现出明显的时间