基于α-synuclein转基因大鼠帕金森病模型的内源性神经毒素致病机制的研究

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1、基于α-synuclein转基因大鼠帕金森病模型的内源性神经毒素致病机制的研究卢剑清2015年6月中图分类号：Q189UDC分类号：616.8基于α-synuclein转基因大鼠帕金森病模型的内源性神经毒素致病机制的研究作者姓名卢剑清学院名称生命学院指导教师邓玉林教授答辩委员会主席范明研究员申请学位工学博士学科专业生物化工学位授予单位北京理工大学论文答辩日期2015年6月11日Theinvestigationofendogenousneurotoxininpathogenesisbasedonthe

2、α-synucleintransgenicratmodelofParkinson'sdiseaseCandidateName：LuJianqingSchoolorDepartment:SchooloflifeFacultyMentor:Prof.DengYulinChair,ThesisCommittee：Prof.FanMingDegreeApplied:DoctorofEngineeringMajor：BiologicalChemicalDegreeby:BeijingInstituteofTe

3、chnologyTheDateofDefence：June11,2015研究成果声明本人郑重声明：所提交的学位论文是我本人在指导教师的指导下进行的研究工作获得的研究成果。尽我所知，文中除特别标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京理工大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的合作者对此研究工作所做的任何贡献均已在学位论文中作了明确的说明并表示了谢意。特此申明。签名：日期：北京理工大学博士学位论文摘要帕金森病（Parkinson’sdi

4、sease，PD）是目前第二大神经退行性疾病，多于老年发病，其症状表现为静止性震颤，身心反应迟钝以及强直等，对生活质量造成严重的影响，且中国PD病人数量呈逐年增长的趋势。PD的两大病理特征为黑质区多巴胺能神经元的丧失与蛋白聚集体——路易小体（LewyBodies，LBs）的形成。关于PD的发病有很多假说，例如氧化应激假说，自由基假说等，然而其发病机制目前尚不清楚。遗传因素和环境因素被认为是PD的两个主要的致病原因，其中环境因素起主导作用。自从MPTP被发现以来，神经毒素作为PD的致病因子受到了广泛关

5、注，儿茶酚四氢异喹啉类化合物（catecholtetrahydroisoquinolines，CTIQs）就是其中一类内源性的神经毒素。本课题组针对CTIQs在体内形成与代谢进行了长期研究，提出了CTIQs类神经毒素脑内形成与神经毒性的假说。当脑受到外界刺激（物理打击或环境污染等）会产生氧化应激导致脂质过氧化（lipidperoxidation，LPO），而LPO的终产物是醛类，醛类与多巴胺（dopamine，DA）反应后生成Salsolinol（Sal）等CTIQs，CTIQs经过氮甲基化和氧化代

6、谢产生能够与线粒体复合体Ⅰ结合的离子化合物，造成细胞能量代谢障碍，进一步加剧氧化应激。另外，形成的CTIQs有可能促进脑内α-synuclein聚集的发生，而聚集进一步产生氧化应激，从而形成循环，其结果使神经元变性死亡。在本课题中，针对以上假说，通过构建α-synuclein转基因大鼠模型，重点研究内源性神经毒素N-methyl-Salsolinol（NMSal）在脑内对α-synuclein聚集的影响，阐明α-synuclein脑内聚集的机制，考察NMSal的神经毒性。通过本文的研究，对上述假说提

7、供实验数据积累。本研究取得了以下成果：1、成功建立了脑内过表达α-synuclein的大鼠PD模型。采用了重组腺相关病毒（RecombinantAdeno-AssociatedViral，rAAV）作为基因表达的载体，在研究过程中13建立了一个简单，高效的纯化rAAV的方法，最终得到了滴度超过10gc/mL的rAAV。利用脑立体定位技术将rAAV注射至大鼠大脑黑质致密部后，经过一系列时间节点的行为学观察，α-synucleinWT组和A53T组都会引发针对单侧多巴胺能神经元损伤的行为——阿扑吗啡诱导

8、向健侧转圈，其中α-synucleinA53T组转圈速度为3.91±1.62圈/min，而WT组速度为2.68±1.74圈/min。对其脑部切片后进行免疫组化检测，外源性α-synuclein特异性地在多巴胺能神经元中表达，其中α-synucleinWT组从第3周至I北京理工大学博士学位论文第12周，表达程度呈逐渐增加的趋势，而α-synucleinA53T组至第9周时表达已至顶峰。同时对多巴胺能神经元标志性物质——酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase