αsynuclein基因在帕金森病发病机制中的作用实验研究

《αsynuclein基因在帕金森病发病机制中的作用实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、上海第二医科大学硕士学位论文α-synuclein基因在帕金森病发病机制中的作用实验研究姓名：李琳申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：刘振国2003.5.1上海第二医科大学硕士学位论文a．synuclein基因在帕金森病发病机制中的作用实验研究中文摘要帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是临床上常见的神经系统变性疾病之一，主要病理特征是黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失。一般认为PD的发病机理可能与环境因素及遗传因素有关。近年来发现0·synuclein基因突变G209A或G

2、88C可引起家族性PD，虽然在分析多例散发性PD时未发现n．synucleln基因突变，但是无论是常染色体显性遗传的家族性PD还是散发性PD脑内都有特征性细胞内包涵体一Lewy小体，而且其主要成分为q-synuelein，故Q—synuetein可能在PD发病过程中起重要作用。本研究采用基因工程手段，进行了人Q—synucleln(hⅡ．synuelein)基因eDNA的克隆，构建了野生型和突变型h口一synuelein的真核表达质粒pEGFP-N1／hn-synuclein(wt／mut)，将h

3、a·synuelein基因转染PCI2细胞使其过表达，并在此基础上观察ha．synuclein过度表达引起细胞的形态学变化，比较野生型和突变型ha-synuclein过表达对PCI2细胞的毒性作用及其对蛋白酶体抑制剂的毒性易感性，初步探讨了a-synuclein基因在PD发病机制中的作用，为进一步的研究奠定基础。本课题分三个部分第一部分：野生型和突变型n-synuclein真核表达载体构建采用RT-PCR从人胚脑组织中扩增人d—synuclein基因，构建至真核表达载体pEGFP-N1中，再采用重

4、叠延伸法(SOE法)定点突变，构建了突变型a．synuclein基因真核表达载体。结果表明所得到的片段与报道序列的同源性达100％(突变型达99％)，并且成功地将片段克隆到了真核表达载体上。第二部分：野生型和突变型hⅡ一synucloin在PCI2细胞中的表达将已构建的pEGFP-N1／hⅡ一synuclein(wt／m,n)重组质粒转染PCI2细胞．Western-blot法证实细胞内有hd-synuelein(wt／mut)融合蛋白表达。野生型和上海第二医科大学硕士学位论文突变型ha．synu

5、clein瞬时表达对PCI2细胞形态无明显影响，它们广泛分布于细胞核与细胞质中，与内源性a．synuclein的分布相一致；采用MTT比色法证实A30P突变型ha．synuclein对PCI2细胞有毒性作用；用磷脂酰丝氨酸外翻分析(ArmexinV)法检测发现突变型d．synuclein基因瞬时表达能够诱导PCI2细胞发生凋亡。第三部分Lactacystin对过表达d-synucleinPCI2细胞的毒性作用采用MTT法检测蛋白酶体抑制剂Lactacystin对PCI2细胞活性的影响，加入Lact

6、acystip224小时后，PCI2细胞活性明显下降，里剂量依赖性，过表达hⅡ-synuclein(wt／mut)-EGFP的PCI2细胞对蛋白酶体抑制剂的毒性易感性增加，免疫荧光法发现蛋白酶体抑制剂可引起野生型和A53T突变型ha-synuclein的聚集增加，但A30P突变型则未见明显聚集。上述结果表明：1、成功地构建了野生型和突变型hn-synuclein真核表达质粒pEGFP-NI／ha—synuclein(wt／mut)，并在PCI2细胞内表达。2、过表达A30P突变型ha-synucl

7、ein对PCI2细胞有毒性作用，可引起PCI2细胞凋亡。3、过表达野生型和突变型hⅡ-synuclcin增加了PCI2细胞对蛋白酶体抑制剂Lactacystin毒性的易感性。4、蛋白酶体抑制剂可引起野生型和A53T突变型ha．synuclein在PCI2细胞内聚积增加，野生型和突变型hQ-synuclein经蛋白酶体降解。【关键词】帕金森病发病机制d-synuclein圭塑苎三墨型查堂堡主堂垡堡壅——ExperimentalStudy011a-SynucleingeneinthePathogene

8、sisofParkinson’sDiseaseParkinson’Sdisease(PD)isoneofcommonneurodegenerativedisorderscharacterizedprimarilybylossofdopaminergicneuronsinthesubstantianigra．Etiologically,PDislikelytheresultofthecumulativeeffectsofthegeneticandenvironmentalfactor