四环素调控人numb基因过表达慢病毒载体的分步构建

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1、分类号：密级：UDC：学号：406520512405南昌大学硕士研究生学位论文四环素调控人Numb基因过表达慢病毒载体的分步构建CONSTRUCTIONOFTETRACYCLINEREGULATEDGENEEXPRESSIONFORHUMANNumbGENEINTWORECOMBINANTLENTIVIRALVECTORS张娟培养单位（院、系）：南昌大学医学部指导教师姓名、职称：李剑教授申请学位的学科门类：医学学科专业名称：内科学（血液病）论文答辩日期：2015年5月29日答辩委员会主席：文珠评阅人：王晓莉肖承京2015年05月29日一、学位论文独创性

2、声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的

3、全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：导师签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日论文题目四环素调控人Numb基因过表达慢病毒载体的分步构建姓名张娟学号406520512405论文级别博士□硕士□√院/系/所南昌大学医学部专业内科学（血液）联系

4、电话E_mail通信地址（邮编）：备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要目的：本课题旨在构建含有四环素调控人Numb基因过表达调控组份的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro慢病毒载体，以及构建含有四环素调控人Numb基因过表达反应组份的Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb慢病毒载体，并测定它们的滴度，为Numb调控人干细胞“干性”的研究提供实验基础。方法：1、采用酶切技术将Lenti-egfp-IRES-puro载体酶切后获得Lenti-IRES-puro骨架。采用凝胶电泳技术验证rtta基

5、因片段。将rtta基因片段连接到Lenti-IRES-puro骨架上得到Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增，提取质粒通过酶切及基因测序验证后，将Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞，分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞，48小时后，通过ELISA方法测定其滴度。2、使用酶切技术将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-OCT4载体酶切后获得Lenti-EF1a-EG

6、FP-TRE骨架。使用RT-PCR技术从人胚胎干细胞总RNA中获得人Numb基因片段，将人Numb基因片段连接到Lenti-EF1a-EGFP-TRE骨架上得到Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒。将重组质粒转入到感受态大肠杆菌中进行质粒的扩增，提取质粒通过酶切及基因测序验证后，将Lenti-EF1a-EGFP-TRE-Numb重组质粒、辅助包装质粒delta、pVSVG共转染293T细胞，分别在转染后48小时和72小时收集病毒及浓缩病毒。将病毒稀释后感染293T细胞，48小时后，通过DAPI细胞染色方法测定其滴度。结果：1、Len

7、ti-egfp-IRES-puro载体经酶切行琼脂糖凝胶电泳后，观察到有两条条带，显示Lenti-IRES-puro骨架获取成功。rtta基因片段行琼脂糖凝胶电泳后，观察到在1kbp附近有条带，显示rtta基因片段获取成功。克隆的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒经酶切行琼脂糖凝胶电泳，观察到有两条条带，经基因测序结果为100%正确，显示Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro重组质粒构建成功。重组质粒与辅助包装质粒共转染293T细胞，感染后48小时收集II摘要的Lenti-EF1a-RTTA-IRES-Puro病毒浓

8、缩液滴度为:6.5*10^7TU/ml，感染后72小时收集的Lenti-EF1a-RTTA-I