低剂量亚砷酸钠致hacat细胞恶性转化过程中involucrin表达变化及其机制研究

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1、ASOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文pic轉論_论文题目低剂量亚砷酸钠致HaCaT细胞恶性____转化过程中Invducriii表达变化及其机制研究研究生姓名马园指导教师姓名安艳专业名称卫生毒理学研究方向环境毒理学论文提交日期2015年4月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对

2、本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：_1[3__日期：沐斗q苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以釆用影印、缩印或其

3、他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在_____年_月解密后适用本规定。非涉密论文qY论文作者签名：.iiS日期:声S、公、1导师签名：日期：一丄7低剂量亚砷酸钠致HaCaT细胞恶性转化过程中Involucrin表达变化及其机制研究中文摘要低剂量亚砷酸钠致HaCaT细胞恶性转化过程中Involucrin表达变化及其机制研究中文摘要目的Involucrin是交联包膜的蛋白前体，其不仅作为表皮角质细胞早期分化的标记，同时也是鳞状上皮

4、细胞终末分化的标记。研究表明，Involucrin在多种肿瘤呈现高表达状态，在肿瘤的诊断中发挥重要作用。然而其在肿瘤发生过程中的不同阶段的表达变化及相应的变化机制目前尚不清楚。本研究以低剂量亚砷酸钠长期染毒致永生化人角质形成细胞(HumanKeratinocytes,HaCaT)恶性转化细胞模型为研究载体，检测此过程中Involucrin表达的动态变化，并以JNK/c-Jun信号通路为切入点探讨引起Involucrin表达变化的分子机制。方法1．建立低剂量亚砷酸钠致HaCaT细胞恶性转化模型：以H

5、aCaT细胞为研究对象，常规培养24h后，再分别加入含有0.0、1.0μmol/LNaAsO2的DMEM完全培养液连续培养直至35代(约18周)后，观察检测细胞恶性程度。2．细胞生长动力学x实验：分别收集传代对照和1.0μmol/LNaAsO2染毒14、21、28和35代处于对数生长期细胞，接种相同数量细胞于二十四孔板中，每天计数，连续六天，最后计算细胞倍增时间。3．软琼脂克隆形成实验：将21、28、35代染毒组和传代对照组的HaCaT细胞分别与0.7%低熔点琼脂糖培养基等体积混合后，铺于含有0.

6、7%低熔点琼脂糖的下层培养基上，凝固后，表面加入适量的DMEM完全培养液，37℃、5%CO2培养，每3d换一次液，培养过程中动态观察，3周后终止培养并停止计数。4．氧化应激指标的检测：收集染毒组处于生长对数期的0、1、7、14、21、28和35代HaCaT细胞，采用流式细胞仪检测不同代数HaCaT细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)水平。I中文摘要低剂量亚砷酸钠致HaCaT细胞恶性转化过程中Involucrin表达变化及其机制研究5．Westernblot检测蛋白的表

7、达：收集染毒组和对照组处于生长对数期的0、1、7、14、21、28和35代HaCaT细胞，提取细胞总蛋白并测定其浓度，然后用SDS-PAGE分离蛋白，转膜，封闭，用特异性一抗孵育4℃过夜，结合二抗后，用化学发光法检测相关蛋白磷酸化水平及其表达情况。6．SP600125抑制JNK的表达：选取含有0.0、1.0μmol/LNaAsO2的DMEM完全培养液连续培养的第35代HaCaT细胞，加入SP600125(JNK的特异性抑制剂)分别作用两天、五天后，检测相关蛋白磷酸化水平及表达改变情况及细胞恶性转化

8、程度。结果1．低剂量NaAsO2连续慢性处理致HaCaT细胞恶性转化：分别用含0.0、1.0μmol/LNaAsO2的DMEM完全培养液连续培养HaCaT细胞18周，从28代开始MMP-9表达明显升高，细胞的迁徙、转移能力逐渐增强；且35代细胞形态明显改变，细胞生长速度加快，倍增时间显著缩短；与此同时，1.0μmol/LNaAsO2染毒的HaCaT细胞能在软琼脂培养基上形成更多、更大的细胞集落，说明此时细胞具有恶性表型。2．低剂量NaAsO2连续慢性处理致HaCaT细胞恶性转化过程