keap1-nrf2are信号通路在砷致hacat细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY博士学位论文指导教师姓名_________________安艳教授专业名称_________________卫生毒理学研究方向_________________环境毒理学论文提交日期2015年5月苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名

2、：日期.•一、苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社)、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在_____年__月解密后适用本规定。非涉密论文0"论文作者签名：姑網日期：Keap

3、1-Nrf2/ARE信号通路在砷致HaCaT细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究中文摘要Keap1-Nrf2/ARE信号通路在砷致HaCaT细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究中文摘要【目的】无机砷是人类确认致癌物，但由于砷与机体作用十分复杂，加之无机砷化合物至今尚未成功复制出致癌动物模型，其确切的致癌机制仍未明确。目前砷致氧化应激机制与砷致表观遗传改变是砷致癌机制的两大热点假说。Keap1-Nrf2/ARE是机体最重要的抗氧化信号通路，其能够有效地保护机体免受各类氧化损伤。然而，近年来研究发现该信号通路持续活化则与肿瘤的发生、发展及耐药性密切相关。但该信号通路在肿

4、瘤发生过程中的不同阶段是如何变化及其变化机制目前尚不清楚。本课题以低剂量亚砷酸钠(NaAsO2)长期染毒人皮肤角质形成细胞(Humankeratinocytecell,HaCaT)诱发恶性转化为载体，研究ROS及Keap-Nrf2/ARE信号通路相关蛋白在恶性转化过程中不同阶段的动态变化，进而更深一步探讨导致该信号通路表达变化可能的分子机制，为砷致癌机制研究提供新思路，同时为为癌症的预防和治疗过程中合理有效地利用和控制该通路提供新策略。【方法】1.建立低水平NaAsO2长期暴露诱发HaCaT细胞发生恶性转化模型：常规培养HaCaT细胞至贴壁并恢复形态后，换用含0.0和1.0

5、μMNaAsO2的DMEM完全培养基连续培养至35代(约18周)。在该过程中不同阶段(21代、28代、35代)进行细胞生长动力学及MMP-9分泌活性检测，软琼脂克隆实验检测其克隆形成能力。2.低水平NaAsO2致HaCaT细胞恶性转化不同阶段(0、1、7、14、21、28、35代)Keap1-Nrf2/ARE信号通路相关指标检测：采用流式细胞仪检测ROS水平变化；生化法检测MDA含量及SOD酶活力变化；采用Western-Blot方法检测细胞总蛋白及核浆蛋白中Nrf2、HO-1、Keap1及Bach1蛋白表达水平。3.低水平NaAsO2致HaCaT细胞恶性转化中后期(14、

6、28、35代)Keap1基因启动子区DNA甲基化检测：提取相关代数HaCaT细胞基因组DNA，采用亚硫酸氢盐修饰后测序法(BisulfitesequencingPCR,BSP)检测Keap1基因启动子区DNA甲基化情况。4.I中文摘要Keap1-Nrf2/ARE信号通路在砷致HaCaT细胞恶性转化过程中的动态变化及其机制研究5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza-dC)处理后各指标检测：将正常HaCaT细胞及1.0μMNaAsO2诱导的恶性转化的HaCaT细胞(T-HaCaT)分别培养于含有0或10μM5-Aza-dC的DMEM培养基中5天后，采用BSP法

7、进行Keap1基因启动子区DNA甲基化检测，采用Western-Blot法检测Keap1-Nrf2/ARE信号通路各蛋白在总蛋白与核浆蛋白中的表达变化，软琼脂克隆法检测细胞克隆形成能力。【结果】1．用1.0μMNaAsO2对HaCaT细胞进行连续染毒后发现：随着染毒代数的增加，HaCaT细胞生长速率逐渐加快，其倍增时间在35代时明显少于传代对照组细胞，MMP-9分泌水平在35代也明显升高，染毒35代细胞能够在软琼脂中形成明显的克隆集落，而正常HaCaT细胞在软琼脂中几乎不能生长(p均<0.05)。2.对低水平NaA