人肝癌细胞系smmc-7721中肝癌干细胞样细胞的初步探讨

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1、授予单位代码10089学号或申请号08010010003HebeiMedicalUniversity硕士学位论文专业学位人肝癌细胞系SMMC-7721中肝癌干细胞样细胞的初步探讨研究生：曹恒导师：王顺祥教授专业：外科学二级学院：第四医院2015年3月河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大

2、学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责f5Ec研宄生签名:导师签章：二级学院领导盖章：•年.）月7^曰,•••河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研宄生签名导师签章：如@年2^月1/^日目录中文摘要…………………………………………………………………1英文摘要…………………………………………………

3、………………4英文缩写…………………………………………………………………8研究论文人肝癌细胞系SMMC-7721中肝癌干细胞样细胞的初步探究前言…………………………………………………………………9材料与方法…………………………………………………………10结果…………………………………………………………………16附图…………………………………………………………………18附表…………………………………………………………………27讨论…………………………………………………………………30结论……………………………………………

4、……………………34参考文献……………………………………………………………34综述原发性肝癌干细胞的研究概况……………………………………37致谢………………………………………………………………………47个人简历…………………………………………………………………48中文摘要人肝癌细胞系SMMC-7721中肝癌干细胞样细胞的初步探究摘要目的：探索获取肝癌干细胞样细胞的方法并观察其生物学特性及肿瘤干细胞表面标志物表达情况。方法：1收集采用普通培养基贴壁培养与采用无血清培养基悬浮培养的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞。2在倒

5、置显微镜下观察两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞的形态学特征。3流式细胞仪检测两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞中肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24的各自表达量。4SYBRGreenⅠReal-TimePCR方法检测两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞中肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24对应的mRNA表达水平的变化情况。5将两种培养方法处理后的人肝癌细胞株SMMC-7721肿瘤细胞各自注射入不同的裸鼠皮下，观察并记录种植瘤

6、的体积，依此比较两种培养方法处理后肿瘤细胞的致瘤能力及体内增殖能力。结果：1两种培养方法处理后肿瘤细胞形态学变化。倒置显微镜下观察到贴壁培养的SMMC-7721肿瘤细胞呈铺路石样生长，排列规整。而悬浮培养后SMMC-7721肿瘤细胞逐渐由单细胞聚集、增殖成球状或类球状。2应用流式细胞仪检测两种培养方法处理后肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24的各自表达量比较。结果显示：悬浮培养组中CD90(571.77±8.70)、CD24(233.56±10.85)的表达量明显高于贴壁培养组(19.15±0.54、17.

7、37±0.15),差异有统计学意义(CD90t=-109.80P=0.00；CD24t=-34.51P=0.00)，但CD133在悬浮培养组(1.42±0.61)与贴壁培养组(1.48±1.09)中的表达量差异无统计学意义(t=0.08P=0.94)。1中文摘要3两种培养方法处理后肿瘤干细胞表面标志CD90、CD133、CD24对应的mRNA表达水平的变化情况。3.1RNA的鉴定紫外线下观察可见有两条明亮的条带，分别对应于28S和18SRNA，另外有一条较暗淡的5S条带。28S和18S条带的光密度值之比约为(1.5～2

8、)：1，并且未见RNA弥散带，表明RNA完整性良好。3.2mRNA相对表达结果Real-TimePCR结果显示，CD90、CD24、CD133基因均有扩增，扩增曲线均进入平台期，熔解曲线呈标准的单峰，无杂峰出现，表明扩增产物特异。若贴壁培养组mRNA的表达量设定为1，则悬浮培养组的CD90、CD24、CD133mRNA相对表达量分