HSF4调控肝癌细胞系SMMC-7721中STAT1基因的表达

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1、分类号：R735.7单位代码：10159密级：公开学号：201520036硕士学位论文中文题目：HSF4调控肝癌细胞系SMMC-7721中STAT1基因的表达英文题目：Stat1istranscriptionallydown-regulatedbyHSF4inhepatomacellsSMMC-7721论文作者：刘鑫指导教师：何群教授学科专业：细胞生物学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文HSF4调控肝癌细胞系SMMC-7721中STAT1基因的表达Stat1istranscriptionallydown-regulatedbyHSF4inh

2、epatomacellsSMMC-7721论文作者刘鑫指导教师何群教授申请学位理学硕士培养单位基础医学院一级学科生物学二级学科细胞生物学研究方向细胞生物学论文起止时间2017年3月—2018年3月论文完成时间2018年5月中国医科大学（辽宁）2018年3月中国医科大学硕士学位论文摘要目的：STAT1保护宿主细胞免受病毒和其他病原体感染，在先天性免疫中起到重要作用。STAT1在肿瘤细胞中具有促凋亡和抗增殖活性，在细胞信号传导过程中起重要作用。然而STAT1在肝细胞癌中的调控机制知之甚少。为了研究stat1表达的调控机制，我们用生物信息学软件对stat1启动

3、子区域结合的转录因子进行分析和预测，并进行验证，发现转录因子HSF4与STAT1表达具有相关性。SMMC-7721中hsf4的RNAi沉默升高STAT1mRNA和蛋白质表达。通过ChIP-seq分析鉴定出STAT1基因的转录起始位点（TSS）上游254-489bp的启动子区域中的HSF4结合位点，预测的结合位点恰好在该区域内并且通过以下EMSA实验得到验证。当与HSF4共转染时，stat1的启动子活性通过荧光素酶报告基因测定来确定。在SMMC-7721中RNAi沉默HSF4后观察到细胞增殖减少和细胞凋亡增加。我们的研究结果将stat1鉴定为HSF4在SM

4、MC-7721细胞系中的新转录靶标，从而为开发肝细胞癌治疗策略提供了基础。目前对stat1的研究，主要关注其本身的功能，stat1的表达调控机制尚未清楚，深入研究stat1有助于揭示肿瘤发生发展的机制，本实验拟从转录因子层面对stat1的调控机制进行研究。研究方法：（1）细胞培养人肝正常细胞系L-02、人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721培养于DMEM培养液（含10%小牛血清），置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。（2）转录因子预测筛选用生物信息学软件JASPAR预测，可能与stat1启动子区结合的转录因子，对预测出的转录因子进行筛选，找出候选基因

5、。（3）HSF4siRNA干扰和建立高表达细胞系慢病毒方法，HSF4的siRNA干扰片段干扰SMMC-7721细胞系将HSF4全基因序列克隆到载体pEX-4中，形成pEX-4-HSF4表达质粒。（4）Real-timePCR检测mRNA表达I中国医科大学硕士学位论文Real-timePCR检测SMMC-7721细胞系HSF4和stat1的表达，及siRNA干扰和转染前后转录因子HSF4和启动子stat1的mRNA表达情况。（转染前后）（5）WesternBlotWesternBlot检测siRNA干扰和转染SMMC-7721细胞系前后，HSF4和STAT

6、1的蛋白表达情况。（6）ChIP-sequencing提取全基因组DNA进行ChIP-sequencing，获取SMMC-7721细胞系中与HSF4结合全基因组DNA。将ChIP-seq提供HSF4结合区域，与JESPAR预测结果进行序列对比，找出stat1与HSF4结合位点。（7）荧光素酶报告基因将该荧光素酶报告基因质粒与hsf4基因表达质粒共转染到hek293细胞中，观察转染前后荧光素表达情况。（8）凋亡实验用PE-7AAD凋亡试剂/流式细胞仪检测HSF4干扰前后SMMC-7721细胞凋亡情况。（9）对实验数据进行统计学处理应用图像采集分析系统分析数

7、据，所得数据用均数±标准差（±s）表示，应用统计软件，用单因素方差分析进行组间比较，P<0.5为有统计学意义，P<0.01为有显著统计学意义。结果：一．JASPER软件预测转录因子结合位点通过生物信息学软件JASPAR，预测出可以与stat1启动子区相结合的转录因子，从中筛选出转录因子HSF4。二、检测HSF4与stat1表达的相关性我们对HSF4和stat1进行RealtimePCR和WesternBlot检测，发现在SMMC-7721细胞系中均表达趋势相反，提示HSF4与stat1表达具有相关性。三、siRNA干扰方法，检测HSF4对STAT1表达的

8、调控作用siRNA干扰SMMC-7721细胞系的HSF4表达，RealtimeP