sirna干扰nox4基因对高糖刺激小鼠肾小球足细胞产生微囊泡的影响

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1、分类号：R587.1学校代码：10062密级：学号：2012602401硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：siRNA干扰NOX4基因对高糖刺激小鼠肾小球足细胞产生微囊泡的影响TITLETheeffectofsiRNAinterferenceNOX4geneforhighglucosestimulatemousepodocytestoproducemicrovesicles一级学科：临床医学二级学科：内科学内分泌与代谢病论文作者：张甜指导教师：孙丽荣天津医科大学研究生院二〇一五年五月分类

2、号：R587.1学校代码：10062密级：学号：2012602401学位类别：科学学位□专业学位□√学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：siRNA干扰NOX4基因对高糖刺激小鼠肾小球足细胞产生微囊泡的影响TITLETheeffectofsiRNAinterferenceNOX4geneforhighglucosestimulatemousepodocytestoproducemicrovesicles一级学科：临床医学二级学科：内科学内分泌与代谢病论文作者：张甜指导教师：孙

3、丽荣教授导师组成员：李明珍副主任医师博士聂秀玲副主任医师博士天津医科大学研究生院二O一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部

4、或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的：本研究进一步探讨NADPH氧化酶NOX4介导的氧化应激对高糖刺激足细胞损伤及产生微囊泡过程中的作用。方法：体外培养MPC-5细胞，高糖组处理因素为30mM葡萄糖。1.采用RT-qPCR、WesternBlot技术分别检测高糖刺

5、激MPC-5细胞2小时、4小时、6小时、12小时、24小时后NOX4mRNA、蛋白的水平，确定高峰时间点。2.对MPC-5细胞进行FAM-siRNA转染，浓度范围为0-150nM，荧光显微镜观察荧光，确定最佳转染浓度。3.以最佳浓度对MPC-5细胞进行siRNA转染，采用RT-qPCR技术筛选转染率最高的siRNA序列。4.将MPC-5细胞分为6组，分别为正常组、NOX4siRNA组、阴性siRNA组、高糖组、高糖+NOX4siRNA组、高糖+阴性siRNA组，高糖干预时间为方法1中NOX4蛋白水平高峰时间点，采

6、用WesternBlot技术检测各组NOX4蛋白的水平，采用ELISA技术检测各组MPC-5细胞产生MVs的含量。5.统计学方法：采用SPSS18.0统计软件分析数据。结果用均数±标准差(xs)表示。两组以上比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.NOX4mRNA检测结果：随高糖刺激时间的延长，NOX4mRNA表达水平呈先升高后降低的趋势，与正常对照（NC）组相比，2小时、4小时、6小时、12小时、24小时分别是NC组的2.61、1.94、1.83、1.52、1.11倍，

7、可见2小时达高峰，随后逐渐下降，差异有统计学（P<0.01）。2.NOX4蛋白检测结果：随高糖刺激时间延长，NOX4蛋白表达量呈先升高后降低的趋势，与正常对照（NC）组相比，2小时、4小时、6小时、12小时、24小时分别是NC组的1.14、2.08、1.63、1.51、0.96倍，可见4小时达高峰，随后逐渐下降，差异有统计学（P<0.01）。3.FAM-siRNA转染MPC-5细胞结果：荧光显微镜下观察足细胞内可见绿色I荧光，当siRNA浓度在50-125nM之间时，随siRNA浓度增加，含有绿色荧光的细胞数目逐

8、渐增多，当siRNA浓度达150nM时，可见多数细胞被杀伤，说明siRNA浓度为125nM时转染效率最佳。4.不同序列siRNA转染足细胞NOX4mRNA检测结果：与正常对照组、lipo2000组、阴性siRNA组、siRNA-A组、siRNA-C组相比，siRNA-B组NOX4mRNA表达水平明显降低（P<0.05），说明siRNA-B序列干扰NOX4基因的效率最佳。5