sirna干扰hbx基因对hepg2.2.15细胞迁移的影响

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1、遵义医学院硕士学位论文siRNA干扰HBx基因对HepG2．2．15细胞迁移的影响肿瘤的转移浸润【l81。研究发现，在肝细胞肝癌(HCC)的侵袭转移中，以血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶一9(涨P一9)为代表的促进微血管生成的因子及蛋白水解酶系统起着重要作用‘1920]。而细胞外基质的降解在肿瘤转移浸润过程中也起了很重要的作用。肿瘤的侵袭转移须完成3个过程，即降解细胞外基质(ECM)的蛋白质，黏附ECM生长，离开ECM向别处转移【2¨。有研究表明VEGF能刺激内皮细胞产生／lNPs，从而激活了基质降解的瀑布式反应，使肿瘤细胞易于穿透，促进

2、肿瘤的浸润、转移‘22，23】；flMPs参与了肝癌的转移过程，已有研究发现MMP一2、MMP一9和基质降解素的活化与肝癌浸润、肝内转移和术后复发有关【24】。肝癌是一种富含血管的肿瘤，肿瘤血管形成在肝癌的复发转移之中起着十分重要的作用【251，要形成新生血管，原血管基底膜必须首先被降解。伴随着血管生成因子的作用，肿瘤细胞诱导更多的蛋白水解酶分泌。蛋白水解酶降解血管基底膜，并使血管内皮细胞之间的相互作用弱化，这样就增加了血管内皮细胞和肿瘤细胞侵入邻近组织并向远处转移的能力。研究发现，表达HBx蛋白的肝癌细胞通过作用细胞外信号调控激酶(ERKs)和PI

3、-3K—AKT／PKB途径激活人转录因子-1(AP一1)和核转录因子(NF)一KB的活性，而这两个转录因子在肿瘤细胞的转移浸润能过程中起很大的作用【261。本课题组的前期研究工作显示：HBx基因与HepG2．2．15细胞的增殖及HBV的复制有关，且HBxsiRNA可下调HepG2．2．15细胞中hTERT和MMP．2的表达，而hTERT和MMP．2与肿瘤的转移侵袭密切相关。鉴于此，本研究旨在应用RNAi技术干扰HBx基因表达，观察HBx基因沉默对HepG2．2．15细胞迁移能力的影响，进一步说明HBV的感染与肝癌的转移浸润关系，从而为肝癌的治疗提供有

4、价值的资料。4遵义医学院硕士学位论文siRNA：：F：扰HBx基因对HepG2．2．15细胞迁移的影响材料与方法1材料1．1细胞株、质粒、菌种，表达乙肝病毒的肝癌细胞株HepG2．2．15博慧斯生物技术公司质粒空载体、pS／HBV／X百奥迈科生物技术有限公司构建菌种DH5a宝生物工程菌1．2主要试剂丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺电泳级琼脂糖限制性内切酶RNAisoPlusPCR己Jl物DMEM高糖培养基胰蛋白酶胎牛血清G01dⅥewTM核酸染料LipofectamineTM2000VEGF、MMP．9抗体DNAmarkerDLl0000PMSFRT-PCR试

5、剂盒质粒大量提取纯化试剂盒PVDF膜Tris其余试剂1．3主要仪器Solarbio公司SPAIN公司TakaRa公司GibcoBRL，USAGibco，USAGibco，USA北京赛百盛生物工程公司InvitrogenUSAAbcam公司TakaRa公司碧云天生物技术研究所TakaRa公司北京庄盟国际基因科技有限公司Millipore公司Promega公司国产分析纯试剂遵义医学院硕士学位论文siRNA干扰HBx基因对UepG2．2．15细胞迁移的影响高速冷冻离心机Beckman公司垂直电泳一转膜装置BIO．RAD公司恒温培养箱上海博讯实业公司高压蒸汽

6、灭菌器美国TOMY公司电热鼓风干燥箱永光明医疗仪器厂PH试纸上海试剂三厂24、96孔培养板美国Costar公司细胞刮美国Costar公司0．22_}tm微孔滤膜除菌器美国Millex—Gp公司TranswelPJ,室美国Costar公司二氧化碳培养箱Beckman公司核酸蛋白测定仪BIO．RAD公司ELX．800酶标仪美国宝特公司净化工作台苏州净化设备厂超低温冰箱海尔公司倒置显微镜日本Olympus公司Milli-Q超纯水系统Milliprore公司AEL．200电子分析天平日本Tokyo公司血球计数板上海申安医疗器械厂721型分光光度计上海第三分析

7、仪器厂凝胶成像系统BIO．RAD公司1．4主要试剂的配制(1)LB液体培养基准确称取分析纯氯化钠盐109，酵母提取物59，蛋白胨109，放置于2000mL大烧杯中，力N900mL双蒸水溶解，用1mol／LHCl或NaOH调节pH至7．3，定容至1L，分装，高压灭菌。(2)LB固体培养基准确称取分析纯氯化钠盐109，酵母提取物59，蛋白胨109，放置于2000mL大烧杯中，}X／900mLT2蒸水溶解，用1mol／LHCl或NaOH调节pH至7．3，称量琼脂粉20g}J1]6遵义医学院硕士学位论文siRNA干扰HBx基因对HepG2．2．15细胞迁移的

8、影响入大烧杯中，定容至1L，分装，高压灭菌。(3)10mg／mL氨苄青霉素(Amp)称量0．5g氨苄青霉素粉