pbcl-2小分子抑制剂的筛选及其分子药理研究

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1、犬ｉｔ裡－大摩ＤＡＬＩＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹｆｉ面士芽位论文ＭＡＳＴＥＲＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ幽Ｂｃ－ｐｌ２小分子抑制剂的蹄选及其分子药理研究、／生学科去丨丨物化学与分子生物学于晓艳作者姓名指导教师张志超教授薛闻副教授―一答辩日期２０１５年６月硕士学位论文Ｂｃ－ｐｌ２小分子抑制剂的節选及其分子药理研究ｏｆ－－ＳｃｒｅｅｎｉｎｇａＳｍａｌｌＭｏｌｅｃｕｌｅｃｌ２ＩｎｈｉｂｉｔｏｒａｎｄＩｔｓＭｏｌｅｃｕｌａｒｐＢＰｈａｒｍａｃｏｌｏｉｃａｌＭ

2、ｅｃｈａｎｉｓｍｇ作者姓名：于晓艳学科、专业：生物化学与分子生物学学号：２１２１８０９０指导教师：张志超教授薛闯副教授完成日期：２０１５．０５大遠理工大旁ＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｙｇｙ大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中巳经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体巳经发表的研究成果，也不包含其他巳申请学位或其他用途使用过的成果一。与我同工作的同志对本研究所做的贡献均巳在

3、论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。－学位论文题目：《ｄＢＣ１２小分子抑制彻的傭选及其分子药理研究》０作者签名日期：＞丨■？年６月日大连理工大学硕士学位论文摘要Ｂｃ－ｌ２家族蛋白是细胞内源凋亡通路的主要调控因子，包括具有促凋亡和抗凋亡功－－ｃ－能的两类蛋白质。其中抗调亡蛋白成员主要包括Ｂｌ２，ＢｃｌＸＬ和Ｍｄ１，它们巳经被确认为抗肿瘤祀标，正在进行小分子ＢＨ３功能模拟研究。ＢＨ３功能模拟分子通过占据ａｘ－抗凋亡蛋白的ＢＨ３结合沟槽，释放促调亡蛋白Ｂ／Ｂａｋ，或者释放ＢＨ３ｏｎｌｙ蛋白激活

4、Ｂ一ａｘ／Ｂａｋ，诱导肿瘤细胞调亡，是类己经进入临床实验阶段的高效、高特异性的抗癌药。一－－近期研宄发现，憐酸化的Ｂｄ２蛋白（ｐＢｄ２）也是个重要的抗肿瘤祀标。许多类型的肿瘤细胞中Ｂｃ－－ｌ２蛋白Ｂｃｌ２３功能被高度磷酸化修饰，并且磷酸化水平与多种ＢＨ－－模拟分子的抗性相关。例如，Ｂｃｌ２（Ｓｅｒ７０）抵抗ＡＢＴ７３７和，在多种白血病细胞系中ｐＯｂａｏｃ－ｔｌａｘ的杀伤作用。但是，目前还没有发现可以直接祀向ｐＢｃｌ２的小分子抑制剂，Ｂｃ－Ｂ－２尤其是至今没有关于ｐｌ２的ＢＨ３沟槽的结构研究，这也限制了ｐｃｌ小分子抑制剂的分子设计。本

5、研宄基于广泛的ＢＨ３功能模拟分子的分子药理机制、结构生物学等研究结论，提出如下假设－ＢＨ：Ｂｃｌ２的憐酸化修饰别构调节了３沟槽的结构，导致其或者增强了对促凋亡蛋白的亲和力，或者在结构上阻断了现有ＢＨ３功能模拟分子的结合而引起药物Ｂｃ－抗性。因此ｌ２抑制剂的蹄选，在本课题组研发的，本研究设计了基于细胞表型的ｐＢＨ３１Ｂ－２ＢＨ功能模拟分子Ｓ的衍生物中，蹄选可能被ｐｃｌ的３沟槽兼容的小分子，并研宄其分子药理机制－。，明确Ｂｄ２憐酸化修饰对其抗调亡功能的调节机制ｃ－２Ｂ－ＨＡ－本文首先利用稳定转染方法获得分别表达非磷酸化Ｂｌ（ｎｐｃｌ２）模拟蛋白

6、（ＡＡＡ－Ｂｃ－２８７Ａ）Ｂｄ－２－ＥＥＥ－Ｂ－２７０Ｅ７Ｅ）ｌＴ６９Ａ／Ｓ７０Ａ／Ｓ蛋白（ＨＡｃｌＴ６９Ｅ／Ｓ／Ｓ８；和ｐ模拟；－的ＨＬ６０早幼粒白血病细胞，对２３个Ｓ１衍生物进行蹄选。结合胚胎成－－纤维细胞毒性实验的交叉蹄选，得到了特异性依赖Ｂｃｌ２通路、措抗ｐＢｃｌ２功能的化合物Ｓ１－１６。－１６－ＥＥＥ－－２接下来，１７３７对Ｂｄ，通过ＩＴＣ和ＥＬＩＡＳ技术分别检测了Ｓ１Ｓ和ＡＢＴ－－－蛋白的亲和力，以及与ＢＢＨ３肽段ＥＥＥＢｃＩ２ＢＨ３结合沟槽的能力。结果表ｉｄ竞争结合－－－－－明Ｓ１１６能够竞争ＢＢＨ３肽段结合ＥｆｉＢｃｌ２

7、的ＢＨ３沟槽，ＡＢＴ７３７和Ｓ１则不ｉｄ而一－－－能，通过定点突变技术进ＥＢｃｌ２蛋白的亲和ＢＨ３。此外步证实了Ｓ１１６对ＥＥ力来自于结合沟槽。－－－－－本论文通过免疫共沉淀实验分别检测了Ｓ１１６，Ｓ１，ＡＢＴ７３７对ＨＬ６０（ＥＥＥＢｃｌ２－－），０ＣＩＡＭＬ３细胞内Ｂｃｌ２家族蛋白相互作用的影响，并用免疫印迹法检测了Ｂａｘ／Ｂａｋ一的激活－、细胞色素Ｃ释放、ＰＡＲＰ的剪切。这系列的实验结果表明Ｓ１１６是通过解离－Ｉ－－ｐＢｃｌ２小分子抑制剂的筛选及其分子药理研究－细胞中Ｂｃ