小分子抑制剂hdm2i抗白血病作用及其分子机制的体内外研究

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1、浙江大学硕士学位论文小分子抑制剂HDM2i抗白血病作用及其分子机制的体内外研究姓名：尤良顺申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：钱文斌201202浙江人学硕十学位论文中文摘要小分子抑制剂HDM2i抗白血病作用及其分子机制的体内外研究浙江大学医学院内科学(血液病学)硕士研究生尤良顺指导老师钱文斌中文摘要第一部分：小分子抑制剂HDM2i对CML和AML细胞的生长抑制作用及其机制研究目的：研究和比较小分子抑制剂HDM2i对AML和CML来源的血液系统恶性肿瘤细胞株的生长抑制作用及诱导凋亡的情况。并初步

2、探索HDM2i抗CML非凋亡依赖的分子机制。方法：MTT法检测生长抑制作用，台盼蓝染色法检测细胞活性，集落培养法观察细胞克隆情况，hoechst染色法、AV／PI流式细胞检测术检测细胞凋亡情况，ReaJ．TimePCR检测Bcr／AblrrlI矾A表达水平以及、vestemb10t法检测caspase9／8／3、PARP、Bcr／Abl及其下游通路蛋白的表达情况。采用SPss11．5统计处理软件分析，以正O．05作为有差别统计学意义，并采取了CalcuSyn软件进行联合指数法分析。结果：1．HDM

3、2i能通过诱导凋亡而起到抗AML作用；2．HDM2i抗CML增殖的机制是非凋亡依赖的，而是靶向白血病融合蛋白Bcr／Abl，抑制其下游信号通路(p—CRKL，JAK-Stat5，p-AKT等)起到抗CML增殖作用；3．HDM2i抗CML作用的效果明显强于传统上调p53蛋白的小分子抑制剂NutliIl3，且并不依赖细胞内Il浙江大学硕‘仁学位论文中文摘要p53蛋白的活性，因此HDM2i较Nutlin3具有更强的抑癌作用。HDM2i增强传统Bcr／Abl抑制剂PDl80970下调Bcr／Abl，诱导C

4、ML细胞株发生明显凋亡，二者具有协同抗CML作用。第二部分：小分子抑制剂HDM2i协同溶癌腺病毒SG511．BECN诱导CML自噬性死亡及其机制研究。目的：研究小分子抑制剂HDM2i诱导CML细胞发生自噬及其分子机制，且溶癌腺病毒SG511．BECN增强HDM2i诱导的自噬具有协同抗CML作用，并通过体内外实验，探讨HDM2i联合SG511．BECN协同抗CML的自噬性死亡机制，以期为临床白血病治疗提供新的方法和策略。方法：通过荧光显微镜观察LC3．GFP．K562荧光改变、A、，O染色激光共聚焦

5、观察荧光自噬小体及透射电镜观察自噬小体等方法检测自噬的发生，MTT法检测生长抑制作用，结晶紫染色法检测细胞活性，集落培养法观察细胞克隆情况，hoechSt染色法、AV／PI流式细胞检测术检测细胞凋亡情况，TCID50法检测病毒扩增水平，westemblot法检测caSpaSe9／3、PAI冲和自噬相关蛋白的表达情况。构建SCID小鼠荷瘤模型并检测药物对小鼠荷瘤的影响。采用SPSS11．5统计处理软件分析，以卿．05作为有差别统计学意义，并采取了CalcuSyIl软件进行联合指数法分析。结果：1．H

6、DM2i能上调beclin．1基因而诱导CML细胞发生自噬，并且证明了该自噬在肿瘤中起非保护作用；2．携带beclin．1基因的新型溶癌腺病毒SG511．BECN能够诱导CML细胞发生自噬性死亡；3．SG511．BECN能够增强HDM2i诱导cML细胞beclin．1蛋白的表达，增强自噬，且二者在体内外具有协同抗CML作用；4．实验最后通过一系列的毒理实验，证明了SG511．BECN、HDM2i及其联用对正常肝脏细胞L02、骨髓正常干(祖)系细胞无毒性作用，进一步证明了sG511．BEcN、HDM

7、2i对于治疗白血病具有肿瘤靶向性。结论：通过体内外的一系列研究，小分子抑制剂HDM2i具有抗白血病作用并不III浙江大学硕上学位论文中文摘要依赖于p53，对cML和AMLp53突变的细胞株都具有明显的生长抑制作用：通过诱导凋亡起到抗AML作用，能够下调Bcr／Abl而发挥抗CML增殖作用，且与传统的Bcr／Abl抑制剂PDl80970具有协同作用。HDM2i通过上调beclin．1蛋白的表达，诱导cML细胞发生自噬，且溶癌腺病毒SG511．BECN增强其诱导的自噬能够导致CML发生自噬性死亡，在体

8、内外发挥协同抗CML作用，且具有肿瘤靶向性特点，以期为临床白血病治疗提供新的方法和策略。关键词：HDM2抑制剂；Nutlin3；氯喹；凋亡；自噬；慢性粒细胞白血病；急性髓系白血病；白血病融合蛋白Bcr／Abl；JAK．Stat5信号通路；溶癌腺病毒；beclin．1；自噬性死亡。IV浙江大学硕．I二学位论文英文摘要Theef扎ctsandthemechanismsofHDM2ionLeukemicceUs：invitrOandinviv0ZhejiangUniVers时School