靶向ns3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究

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1、ZSTUZhejiangSci-TechUniversity硕士学位论文Master’sThesis中文论文题目:靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究英文论文题目:DiscoveryandmechanisminvestigationofsmallmolecularinhibitortargetingDenguevirusNS3pro学科专业：生态学作者姓名：吴登伟导师姓名：许传莲递交日期：2015年1月7日浙江理工大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他

2、人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江理工大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。:位论文作者签名年月日/签字曰期：学位论文版权使用授权书太举仿

3、女作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。太人播叔浙江理工大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保农Tli學女、（保密的学位i文在解密后适用本授权书）签字日期：W年5月H日导师签名：签字曰期：年J月八曰浙江理工大学硕士学位

4、论文靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究摘要登革病毒（Denguevirus，DENV）是一类在热带与亚热带地区广泛流行的病原体，其与黄热病毒（YFV），乙型脑炎病毒（JEV）和西尼罗河病毒（WNV）等同属于黄病毒属家族。登革病毒包括DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4四种血清型，其中以DENV-2最为流行。人感染其中任意一型登革病毒均会导致一系列严重的传染疾病，如登革热（Denguefever，DF），登革出血热（Denguehemorrhagicfever，DHF）以及登革热休克综合征（Dengueshocksyndrome，DSS）。目

5、前，全球热带及亚热带地区每年大约有3.9亿人被登革病毒感染，其中9600万人因此患病。截止目前为止人们尚未研制出有效的抗登革病毒药物，此外疫苗的开发也由于登革病毒本身具有的抗体依赖性感染增强作用（Antibodydependentenhancement，ADE）变得异常艰难。因此，寻找开发出一种新的有效抗登革病毒药物迫在眉睫。非结构蛋白3（Non-structuralprotein3，NS3）是登革病毒所编码的一种极为重要的蛋白，其N端是一种具有丝氨酸蛋白酶催化三联体结构的类胰蛋白酶。NS3主要参与登革病毒编码的前体蛋白剪切，这对病毒的成熟以及复制均十分关键。NS3的蛋白酶活性

6、需要在NS2B的存在时才能被激活，作为辅因子的NS2B可以将NS3的酶活力提高3300-6600倍。由于复合蛋白NS2B/NS3pro（NS2B/NS3protease）对登革病毒成熟以及复制起着至关重要的作用，目前其已成为一个重要的抗登革病毒药物开发靶点。因此，NS2B/NS3pro的抑制剂的发现与作用机制研究具有十分重大的意义。本课题通过将pET15b-DENV-2-NS2B/NS3重组质粒转化至EscherichiacoliBL21(DE3)中进行诱导表达NS2B/NS3pro；采用镍柱亲和层析法得到高纯度的NS2B/NS3pro；利用高通量筛选平台对实验室现存化合物库进

7、行NS2B/NS3pro抑制剂的筛选；并用MTT比色法检测NS2B/NS3pro候选抑制剂的细胞毒性；同时采用病毒复制子抑制实验评价候选化合物对DENV-2病毒复制的抑制效果；最后综合利用酶动力学，表面等离子共振技术，差式扫描量热法，紫外光谱法，分子模拟对接以及蛋白质定点突变等技术方法原理对化合物抑制NS2B/NS3pro蛋白酶活性机制进行研究，结果表明：NS2B/NS3pro抑制剂（化合物MT02A3101）具有极低的细胞毒性同时表现出良好的抑制登革病毒复制活性；MT02A3101作为一个NS2B/NS3pro的竞争性抑制剂与NS2B/NS3pro底物结合口袋存在强烈的结合同

8、时使NS2B/NS3pro的热稳定性下降从而抑制其蛋白酶活性；此外还发现MT02A3101与NS2B/NS3pro的106位Gln，114位Gln，132位Thr及133位Arg生成氢键，同时与109I浙江理工大学硕士学位论文靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究位Ile，115位Ile及131位Val存在疏水作用。关键字：登革病毒；NS2B/NS3pro抑制剂；作用机制；结合模型II浙江理工大学硕士学位论文靶向NS3的抗登革病毒小分子抑制剂的发现及作用机制研究Abstrac