Cpf1的小分子抑制剂的筛选与复合物结晶的研究.pdf

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1、硕士学位论文Cpf1的小分子抑制剂的筛选与复合物结晶的研究THESTUDYOFSCREENINGANDCOMPLEXCRYSTALLIZATIONOFSMALLMOLECULARINHIBITORSOFCPF1杨建争哈尔滨工业大学2018年6月国内图书分类号：Q71学校代码：10213国际图书分类号：577.21密级：公开理学硕士学位论文Cpf1的小分子抑制剂的筛选与复合物结晶的研究硕士研究生：杨建争导师：黄志伟教授申请学位：理学硕士学科：生物学所在单位：生命科学与技术学院答辩日期：2018年6月授予学位单位：哈尔滨工业大学Classif

2、iedIndex:Q71U.D.C:577.21DissertationfortheMasterDegreeinScienceTHESTUDYOFSCREENINGANDCOMPLEXCRYSTALLIZATIONOFSMALLMOLECULARINHIBITORSOFCPF1Candidate：YangJianzhengSupervisor：Prof.HuangZhiweiAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeS

3、cienceandTechnologyDateofDefence：June,2017Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈尔滨工业大学理学硕士学位论文摘要CRISPR/Cpf1系统作为CRISPR/Cas9系统之后研究最多的CRISPR系统之一，已得到了许多研究者的深入研究和广泛应用。与Cas9相比，Cpf1具有蛋白分子量小，组成简单，切割产生黏性末端且同时具有同时具有DNA和RNA内切酶活性等优点，因此在将来有望成为最有效应用最广泛的基因编辑工具之一。本课题以

4、LachnospiraceaebacteriumND2006Cpf1（LbCpf1）蛋白为研究对象，利用分子克隆等生物实验方法，表达和纯化出大量的LbCpf1蛋白，通过体外转录方法得到了的LbCpf1蛋白发挥DNA内切酶活性所必需的crRNA。我们从实验室购买的小分子库中成功筛选出14种小分子抑制剂。为探究筛选出的小分子抑制剂对LbCpf1蛋白的DNA酶活性抑制机理，我们进行了GSTpulldown及EMSA等分子生物学实验。结果表明有一种小分子是通过抑制LbCpf1蛋白与crRNA的结合从而抑制了LbCpf1蛋白的DNA酶活性；有4种小

5、分子通过抑制目的DNA与LbCpf1-crRNA二元复合物的结合抑制了LbCpf1蛋白的DNA酶切活性。最后，为进一步探究小分子抑制剂对LbCpf1蛋白DNA酶活性的抑制机制，我们将每种小分子抑制剂与其对应的蛋白或蛋白-核酸复合体进行混合后用晶体试剂盒筛选晶体，经过大量筛选和优化，成功筛选出3种小分子与蛋白复合物晶体，为后续的晶体优化研究奠定了基础。关键词：LbCpf1；蛋白纯化；小分子抑制剂；蛋白晶体筛选I哈尔滨工业大学理学硕士学位论文AbstractCRISPR/Cpf1systemisoneofthemostresearchedCR

6、ISPRsystemsafterCRISPR/Cas9system,andhasbeendeeplystudiedandwidelyusedbymanyresearchers.ComparedwithCas9,Cpf1hastheadvantagesofsmallproteinmolecuLarweight,simplecomposition,andtheproductionofstickyendsandhasbothDNAandRNAendonucleaseactivityatthesametime.Itisexpectedtobeco

7、meoneofthemosteffectiveandmostwidelyusedgeneeditingtoolsinthefuture.Inthisstudy,LachnospiraceaebacteriumND2006Cpf1(LbCpf1)proteinwasusedastheresearchobject,andalargenumberofLbCpf1proteinswereexpressedandpurifiedbymolecularbiologicalmethodssuchasmolecularcloning.Weobtained

8、thecrRNA,whichplaysanimportantroleintheactivityofDNAendonucleaseforLbCpf1protein,throughtheinvit