npy对tnf-α诱导的caco-2细胞凋亡的影响及其机制

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1、NPY对TNF-α诱导的Caco-2细胞凋亡的影响及其机制EffectsandMechansimsofNPYonTNF-α-inducedCaco-2CellsApoptosis作者姓名：刘红梅专业名称：基础兽医学指导教师：柳巨雄教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年06月06日本研究资助项目NPY在大鼠炎症性肠病中的作用及其机制国家自然科学基金(31072100)Ghrelin对奶牛乳蛋白合成的影响及机制研究国家自然科学基金（31372396）中文摘要NPY对TNF-α诱导的Caco-2细胞凋亡的影

2、响及其机制近年来提出一种不同于自噬和坏死性凋亡的新的细胞形态学变化，即凋亡（Apoptosis）。凋亡是机体为维持内环境的稳态而产生的一种细胞自主性死亡过程，它是由种属之间非常保守的基因（例如Bcl-2家族、Caspase家族、抑癌基因P53等）调控的。细胞在一些应激过程中，线粒体膜电势改变且通透性增加,细胞色素C（Cytochromec,CytC）、凋亡诱导因子（Apoptosisinducingfactor,AIF）等从线粒体中释放到细胞质中，从而改变了线粒体上凋亡相关蛋白（例如Bax、Bcl-2等）

3、的表达量，并且进一步形成凋亡体活化Caspase-9等。同时，细胞凋亡还可以在细胞受到死亡信号的“攻击”时发生。细胞凋亡往往是单个细胞，或者是在一部分细胞中非同步进行。凋亡的形态学变化是细胞质密度增加，并且由细胞膜的翻转形成小泡，包裹凋亡遗骸形成凋亡小体。神经肽Y（NeuropeptidesY，NPY）是由36个氨基酸残基组成的多肽，包含有酰胺化的C-末端和大量的酪氨酸残基。NPY主要分布在中枢神经和外周器官中，成熟的NPY被酶切割后的活性分子与相应的受体结合后发挥其功能。其主要的生理功能是调节神经递质的

4、释放；影响微生物-脑-肠轴，例如运动性、分泌物和血流量；调节免疫系统活性；抑制疼痛在脊髓和脑干中的传播等。此外还有研究表明NPY可以诱导血管平滑肌细胞的凋亡，并且可以影响肝细胞和视神经细胞等的凋亡活动。既然NPY对微生物-脑-肠轴有一定的影响，而且NPY还参与某些细胞的凋亡活动，那么NPY是否会影响肠上皮细胞的凋亡呢？如果NPY影响肠上皮细胞的凋亡，那么其具体机制是什么？目前未见相关研究报道。因此本实验首先用不同浓度的TNF-α处理Caco-2细胞，不同时间点后，通过MTT、DAPI染色法和流式细胞术检测

5、TNF-α对Caco-2细胞凋亡的影响，建立Caco-2细胞凋亡模型；通过流式细胞术检测NPY预处理对TNF-α诱导的Caco-2细胞凋亡的影响；通过蛋白质免疫印记检测NPY预处理对TNF-α诱导的Caco-2细胞中凋亡标志性蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2、CytC等表达I量的变化，以确定NPY抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞凋亡的机制；最后添加NPY受体特异性抑制剂，用流式细胞术检测Caco-2细胞凋亡率变化，从而更进一步确定NPY抑制TNF-α诱

6、导的Caco-2细胞凋亡的机制。实验结果表明，与NT组相比较，30ng/mL的TNF-α处理Caco-2细胞24h后能显著抑制Caco-2细胞的增殖，并且同时诱导细胞发生凋亡，凋亡率高达54.50%。10nM的NPY对TNF-α诱导的Caco-2细胞凋亡有抑制作用。在此过程中TNF-α组与NT组相比较Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9以及Bcl2的表达量降低，Bax、CYTC的表达量增加；NPY+TNF-α组与TNF-α组相比较Caspase-3、Caspase-8、Caspase

7、-9以及Bcl2的表达量增加，Bax、CytC的表达量降低。在Caco-2细胞膜表面的NPY受体有Y1、Y2、Y4、Y5，并且在NPY抑制TNF-α诱导的Caco-2细胞凋亡过程中明显发生变化的受体是Y1，加入Y1受体特异性阻断剂BIBP3226后，与NPY+TNF-α组相比较BIBP3226+NPY+TNF-α组的凋亡率增加。以上研究表明，NPY通过与Caco-2细胞膜上的Y1受体介导了下游凋亡信号通路，从而抑制了TNF-α诱导的Caco-2细胞的凋亡。关键词：TNF-α，Caco-2细胞，NPY，凋亡

8、IIAbstractEffectsandMechansimsofNPYonTNF-α-inducedCaco-2CellsApoptosisRecently,anewconceptofmorphologyhavebeenproposed,whichwasdifferentfromautophagyandnecroptosis,thatwasapoptosis.Inordertomanintainthehomeostasisof