ipscs-mscs来源的外泌体修复缺血性组织损伤的作用及其机制研究

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1、分类号：密级：UDC：学号：406521212488南昌大学硕士研究生学位论文iPSCs-MSCs来源的外泌体修复缺血性组织损伤的作用及其机制研究TheroleandmechanismofexosomessecretedbyiPSCs-MSCsinrepairingofischemictissuedamage胡国文培养单位（院、系）：南昌大学第二附属医院指导教师姓名、职称：邓志锋主任医师教授申请学位的学科门类：医学学科专业名称：外科学（神经外科）论文答辩日期：2015年5月答辩委员会主席：评阅人：2015年

2、5月学位论文独创性声明一、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门

3、或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：导师签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日论文题目姓名学号论文级别博士□

4、硕士□院/系/所专业E_mail备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要研究背景与目的：缺血性组织损伤是临床缺血性疾病中常见的病理过程，缺血性心脏病、缺血性脑血管病及缺血性外周血管病等都可因缺血缺氧而造成组织器官的功能受损，尽快恢复缺血组织的血液供给有助于各种缺血性损伤的修复。近年来，利用干细胞移植修复缺血性组织损伤的相关研究十分活跃，由诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPSCs）分化而来的间充质干细胞（mesenchymalstem

5、cells,MSCs）展现出较成体MSCs更强大的减轻缺血性组织损伤，促进缺血组织血管新生及功能恢复的功能，因而在干细胞治疗领域展现了良好的应用前景。但是，干细胞移植应用于临床治疗始终存在一定风险，如遗传物质变异、移植细胞栓塞血管和致瘤致畸等。最新研究发现干细胞主要通过旁分泌机制发挥其治疗功能，而外泌体是其中一种重要的旁分泌因子。外泌体是细胞分泌的一种直径约40～100nm的囊泡，其内包裹有来源细胞内的多种蛋白质、miRNAs等物质，在缺血性损伤组织内直接移植干细胞来源外泌体可以发挥类似移植干细胞样的修复组

6、织损伤的作用。因此，由诱导多能干细胞分化形成的间充质干细胞（iPSCs-MSCs,iMSCs）来源的外泌体（iMSCs-exosome,iMSC-Exo）是否具有强大的修复缺血性损伤的功能值得深入研究。本实验通过建立下肢缺血模型及脑缺血模型模拟人体常见的外周及中枢系统缺血性疾病，在此基础上观察iMSC-Exo对缺血下肢及缺血脑组织的修复作用，并分析是否通过促进缺血组织的血管新生发挥此修复功能，随后体外实验进一步分析其促血管新生的功能及可能的机制。通过此项研究，以期为缺血性疾病的治疗提供一条新模式。研究内容和

7、方法：1.iPSCs向MSCs定向分化及iMSC-Exo的富集1.1iPSCs向MSCs定向分化：采用一步法将iPSCs定向分化为MSCs；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测各细胞多能干性基因及中胚层基因表达水平；流式细胞术鉴定iMSCs表面标志物的表达；采用经典的成骨、成脂、成软骨诱导法检测iMSCs的多向分化潜能。II摘要1.2iMSC-Exo的富集与鉴定：无血清培养基培养iMSCs48h，超速离心法收集iMSC-Exo；透射电镜观察iMSC-Exo的形态；高分辨率可调电阻脉冲技术确定iMSC-E

8、xo的直径；Westernblot鉴定iMSC-Exo的特异标志物。2.体内实验观察iMSC-Exo对缺血组织的修复作用及对血管新生的影响2.1iMSC-Exo对缺血下肢的修复作用及对血管新生的影响2.1.1建立小鼠下肢缺血模型（Hind-limbischemia,HLI），股四头肌内多点注射法移植iMSC-Exo。2.1.2缺血下肢梗死程度的比较及缺血肌肉细胞形态变化：统计术后21天各组小鼠缺血下肢梗死程度：完