人尿源干细胞来源的外泌体对1型糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其机制研究

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3、eticNephropathy,DN)是糖尿病的主要并发症，也是导致终末期肾病的主要原因。DN病理早期表现为足细胞凋亡、数量减少，引发滤过膜功能障碍，最终造成大量蛋白尿和肾功能衰竭。因此，抑制足细胞凋亡，减少蛋白尿是DN预防和治疗中的关键问题。研究已经发现干细胞对DN有良好的治疗作用，这种作用可能与干细胞的旁分泌机制有关。其中，外泌体（Exosomes）是干细胞旁分泌机制中发挥作用的有效成分。但是用干细胞来源的Exosomes治疗DN的研究罕有报道。本课题通过建立1型DN大鼠模型，研究USCs来源的Exosomes（USCs-Exo）对DN肾脏损伤的

4、保护作用，探讨其可能的机制。方法方法：方法：：：①USCs及其分泌USCs-Exo的分离、培养、鉴定：采用特定培养基从人的尿液中分离USCs，通过流式细胞术鉴定其表面标记分子，并对其多向分化潜能进行鉴定。采用超高速离心法从USCs培养上清中提取USCs-Exo，透射电镜分析其形态、大小，蛋白质免疫印迹法（Westernblotting)法检测特异性蛋白CD9、CD63和CD81的表达。②1型糖尿病大鼠模型的建立、分组：采用链脲佐菌素腹腔注射构建1型糖尿病大鼠模型，实验分为：正常对照组(Normal),糖尿病组(Diabetes)和糖尿病USCs-Ex

5、o治疗组(Diabetes+USCs-Exo)。③USCs-Exo对1型糖尿病大鼠肾脏的保护作用:每周检测各组大鼠的随机血糖，每4周检测血清肌酐、尿素氮，收集24小时尿液检测尿肌酐、尿白蛋白水平，计算尿微量白蛋白/肌酐（urinarymicroalbumin-to-creatinineratio，UACR)。12周后处死大鼠，PAS染色进行肾组织病理学检查，普通光学显微镜观察肾小球系膜基质增生变化，并计算肾小球系膜面积（Mesangialarea）TUNEL法染色观察肾小球细胞凋亡情况；RealtimePCR法和WesternI中文摘要人尿源干细胞来

6、源的外泌体对1型糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其机制研究blotting法检测）肾脏组织的凋亡相关Bcl-2、Bax和Caspase-3基因和蛋白的表达水平。④USCs-Exo对体外高糖刺激的人足细胞（HumanPodocyte,HPDC）的保护作用：USCs-Exo干预高糖培养HPDC分为——正常葡萄糖对照组（NG组）、甘露醇高渗对照组(MA组)、高糖组（HG组）、HG+USCs-Exo（5ug/ml,10ug/ml和50ug/ml）干预组；72小时后，采用AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞术检测细胞的凋亡率，Westernblotting

7、法检测HPDC凋亡蛋白Caspase-3的表达,RealtimePCR检测足细胞特异性分子Synaptopodin的基因相对表达量。结果结果：结果：：：①从新鲜尿液中成功分离出USCs和USCs-Exo，为进一步的实验设计提供了充足可靠的原料：USCs培养5-7天后开始贴壁生长，12-16天类似成纤维细胞样的细胞呈集落生长，传代2-3次后细胞逐渐被拉长，保持均一的成纤维细胞样生长。USCs表达间充质干细胞相似的表面分子CD29、CD90、CD73、CD44,不表达CD34和HLA-DR，表明USCs符合间充质干细胞的特征，同时USCs在体外经成骨、成

8、脂培养基的诱导培养后,USCs成功分化为成骨、成脂细胞。从P3代USCs的条件培养基中提取出USCs-Exo