骨髓来源细胞参和肝脏损伤后修复作用及其机制实验的研究-

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1、第三军医大学硕士学位论文骨髓来源细胞参与肝脏损伤后修复的作用*及其机制的实验研究摘要[背景及目的]终末期肝病(endstageliverdisease,ESLD)是急、慢性肝病的终末阶段，常伴有肝衰竭的临床表现。传统治疗终末期肝病的方法有限，且死亡率高。肝移植(Livertransplantation)是目前最有效的治疗方法，但存在供体肝缺乏、移植后免疫排斥反应及高额治疗费用等问题而难以普遍开展，而干细胞移植是目前治疗终末期肝病的一种可能有效的治疗方法。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞。已有体外研究证实骨髓来源的干细

2、胞在一定条件下可以转化为肝脏细胞。移植了男性骨髓的女性白血病患者，其肝脏活检组织中亦发现有Y染色体阳性的肝细胞，提示骨髓来源的干细胞具有分化为肝细胞，参与肝脏修复的功能。骨髓来源细胞(bonemarrowderivedcells，BMDCs)中主要包含两种类型的干细胞，即造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)和间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)。但BMDCs是如何参与肝脏损伤修复的及其可能的机制目前并不十分清楚。基于以上分析，本实验拟首先构建骨髓嵌合型小鼠模型，并采用四氯化碳(CC

3、l4)致骨髓嵌合型小鼠肝损伤，采用FISH+免疫荧光双标记的方法，通过激光共聚焦显微镜观察在肝损伤后不同时相点，BMDCs在肝脏的归巢、分化及与原位干细胞融合的情况，并对干细胞相关因子SDF-1、CXCR4、HGF、SCF进行检测，以明确BMDCs在肝脏损伤后修复中的作用及其可能机制。进一步结合本课题组其他人员的工作基础，系统研究了microRNA(miRNA)通过对SDF-1的调控作用影响干细胞的趋化及组织修复能力，为干细胞治疗终末期肝病的临床应用提供理论依据。[方法]1、分离C57BL/6小鼠骨髓干细胞(BMDCs)，并经尾静脉移植给

4、到致死剂量(10Gy)照射的同种属异性的C57BL/6小鼠，重建其骨髓造血系统，以建立稳定的骨髓嵌合型*本课题受国家自然科学基金(30772252)、创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室开放基金(SKLK200923)、第三军医大学临床创新基金(2009)、重庆市杰出青年基金(CSTC2009BA5045)资助8第三军医大学硕士学位论文小鼠模型。2、采用CCl4腹腔注射至骨髓嵌合型小鼠，构建急性肝损伤模型。3、10Gy照射C57BL/6雌性小鼠后，移植其同种属雄性小鼠的BMDCs或MSCs。21d后，受体鼠经CCl4致急性肝损伤，肝损伤后第2

5、、3、4、7、14、21、28d分别取其肝脏标本，部分标本制成冰冻切片，行Y染色体原位杂交检测(FISH)与肝白蛋白(ALB)免疫荧光染色的双标记实验，于激光共聚焦显微镜下观察BMDCs的趋化与转分化情况；部分标本做匀浆处理后，通过ELISA方法检测损伤肝脏组织中SDF-1、CXCR4、HGF、SCF的表达情况。4、10Gy照射C57BL/6雄性小鼠后，移植其同种属雌性绿色荧光(GFP)转基因小鼠的BMDCs。21d后使用CCl4致受体鼠肝损伤，分别取肝损伤后第14、21d肝脏标本制成肝冻切片，行Y-FISH与GFP蛋白免疫荧光染色的双标

6、记试验，于激光共聚焦显微镜下观察BMDCs的趋化与融合情况。5、分离雄性C57BL/6小鼠BMDCs，将细胞平均分成两等份，其中一份加入SDF-1抑制剂(17-AAG)，于37℃下孵育30min；另一份不加入SDF-1抑制剂。将10Gy照射的C57BL/6雌性受体小鼠分为两组，一组移植加入抑制剂的BMDCs，另一组移植未加入抑制剂的BMDCs。21d后使用CCl4致受体鼠肝损伤，取肝损伤后21d肝脏，制成肝脏冰冻切片，进行Y染色体原位杂交检测(FISH)与肝白蛋白(ALB)的免疫荧光染色双标记，于激光共聚焦显微镜下观察SDF-1对BMDC

7、s的趋化情况。6、通过real-timePCR技术检测正常肝组织及肝损伤后21天的肝组织中相关miRNA的含量变化。进一步使用双荧光素酶实验、Westernblot以及点突变实验对SDF-1具有调控作用的相关miRNA进行鉴定。7、采用Transwell穿膜实验对SDF-1调控相关miRNA进行功能分析，观察SDF-1调控相关miRNA在体外对间充质干细胞趋化能力的影响。[结果]1、分离了C57BL/6的BMDCs，并将其移植给经10Gy照射后的同种属异性别的受体鼠，成功构建了稳定的C57BL/6骨髓嵌合小鼠模型。2、使用浓度为0.3%的

8、CCl4油剂造成受体鼠急性肝损伤，肝细胞出现大片的变性、坏死，成功构建了CCl4致肝脏急性损伤的小鼠模型。3、通过使用FISH+免疫荧光双标记的方法，激光共聚焦显微镜下在肝脏冰冻切片中可以观察