atra对k562细胞中h0xa5基因表达的影响及其与细胞周期、凋亡关系的研究

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1、.V'‘中图分类号：R72.5KP^)t^kSICHUANMEDICALUNIVERSITY..<；；硕士学位论文--------------------------------------------------"■ATRA对K562细胞中H0XA5基因表达的影晌及其与细胞周期、凋亡关系的研究院（系)、所.临床医学院研究生姓名.滕学科、专业.jis^导师姓名刘文君教桴，屬'、藏二〇—五年四月1本课题受如下基金资助:四川省科技厅应用基础研究川科发计【201410】-2-目录1ATRA对K562细胞中HOXA5基因表达的影

2、响及其与细胞周期、凋亡关系的究………………………………………………11.1中文摘要………………………………………………………11.2英文摘要………………………………………………………41.3前言……………………………………………………………81.4材料与方法……………………………………………………111.5结果……………………………………………………………251.6讨论……………………………………………………………351.7结论……………………………………………………………391.8参考文献…………………………………………

3、……………401.9英汉缩略词对照表……………………………………………452致谢……………………………………………………………463RNA干扰靶向白血病HOXA基因研究进展……………………47-3-ATRA对K562细胞中HOXA5基因表达的影响及其与细胞周期、凋亡关系的研究摘要目的：本课题旨在通过全反式维甲酸(All-TransRetinoicAcid，ATRA)对人髓系白血病细胞株K562细胞的干预来分析同源盒基因(Homeoboxgenes，HOX)A5的表达变化及其与凋亡率、细胞周期的关系，探讨HOXA5在髓系白血

4、病发生、发展过程中的作用。为临床治疗白血病提供实验依据。方法：1.采用肿瘤细胞体外培养技术培养人髓系白血病细胞K562细胞作为实验模型。2.细胞增殖-毒性实验(CellCountingKit-8，CCK-8)：测定用不同浓度的ATRA干预K562细胞24h、48h、72h、96h后，对K562细胞的增殖抑制情况，以确定ATRA干预K562细胞的最佳浓度值。53.实验分组：取对数生长期细胞(约10/ml)，将K562细胞随机分为ATRA干预组(实验组)和对照组。实验组设立三个时间亚组，以10.0umol/L的ATRA分别干预

5、24h、48h和72h；对照组用培养基代替ATRA，其余同ATRA干预组。4.流式细胞术检测：测定10.0umol/LATRA分别干预K562细胞24h、48h、72h后，各组细胞的凋亡情况。5.流式细胞分析仪检测：检测并分析10.0umol/LATRA干预K562细胞不同时间后，与相应的对照组相比细胞周期分布的变化。-4-6.实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测：测定10.0umol/LATRA干预K562细胞24h、48h、72h后，细胞中HOXA5mRNA的表达情况，并分析HOXA5mRNA的表达与细胞周期、凋

6、亡的关系。7.蛋白免疫印迹(Westernblot)法检测：测定10.0umol/LATRA干预K562细胞24h、48h、72h后细胞中HOXA5蛋白的表达情况，并分析HOXA5蛋白表达与细胞周期、凋亡的关系。8.统计方法分析：将实验结果通过统计学SPSS17.0软件处理，以P<0.05为差异有统计学意义。两变量间相关性分析采用Spearman等级相关分析检验，a=0.05为显著性检验水准。结果:1.CCK-8结果显示：ATRA可以抑制K562细胞的增殖，各实验组与对照组相比，OD值的差异有统计学意义(P<0.05)。A

7、TRA干预浓度为7.5umol/L、10.0umol/L时，各组细胞在不同时间点的生长趋势最佳。本实验最终选取10.0umol/L作为干预药物浓度。2.流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示：实验组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)，且各实验组随着药物干预时间的延长，细胞凋亡率也逐渐增加(P<0.05)。3.流式细胞术检测细胞周期分布显示：ATRA干预K562细胞24h、48h、72h后，G0/G1期比例增高，S期比例降低，细胞增殖周期被阻抑在G0/G1期，细胞增殖受到抑制。4.RT-PCR结果显示：K562细胞中可以检测

8、到HOXA5mRNA的表达，实验组HOXA5mRNA的表达量较对照组升高(P<0.05)，且-5-随着干预时间延长各实验组间HOXA5mRNA的表达量也逐渐增加(P<0.05)。5.WesternBlot结果显示：HOXA5蛋白高表达于K562细胞中，ATRA干预组表达量较正常对照组高(P<0.05)，