过氧化氢诱导弓形虫rh株速殖子凋亡的初步研究

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2、ｒ；箱三異茜聲ｒ＾巧護￣，坐姓名霉奔＾朱勇！Ｊ＇指导教师—、职称；杨秋林副教授＇《。－．－‘獻．Ｖ嘴義逢兵審化＇Ｔ：細医爭．補＇—巧矿．个邱：病原生物拳隆繫夢己ｉｔ蔡３＾＾；Ｓｐｌ秦定〇－五年五乐ｒｉ織扭聲毒藝；晋苗过氧化氮对弓形虫畑株速猜子淵亡的初步研究论文作者签名：軟指导教师签名：杨Ｗ未１论文评阅人；张艳，教授，硕导，南华大学民学院评阁人２；刘彦，副教授，南华大学民学院评阅人３；答辩委员会主席：肖律华，教授，博导，南华大学睽学院委员张秋相榜一，硕导，南华大学

3、附属第睽院，教委员２；曾铁兵委，教按，硕导，南华大学民举院委员３；刘安元，副教榜，硕导，南华大学民学院委员４刘双牟，副教巧，硕导，南华大学附属第一医院委员５：员６；答辩日期：２０１５年５月２４日过氧化氢诱导弓形虫RH株速殖子凋亡的初步研究摘要：刚地弓形虫病是一种在全球内普遍流行的人兽共患寄生虫病。不仅对孕妇和胎儿构成了极大的威胁，近年来又成为AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一。目前抗弓形虫药物大部分都存在长期治疗效果差、难根治、高费用且对免疫功能缺陷患者基本无治疗效果等诸多缺点，研发新

4、型治疗弓形虫病药物很有必要。药物研究依赖于高效稳定的弓形虫体内和体外培养模型，建立弓形虫培养模型不仅可用于筛选新型抗弓形虫药物，还可用于抗弓形虫药物的作用机理研究。过氧化氢(HydrogenPeroxide，H2O2)对细胞的活力和增殖力均具有抑制和/或杀伤作用，然而有关H2O2能否诱导弓形虫凋亡的作用机制仍然不清楚。近年来,不少数据表明，H2O2可以诱导众多细胞凋亡，本文以H2O2是否能诱导弓形虫速殖子凋亡作探讨，旨在进一步阐明H2O2诱导弓形虫RH株凋亡的机制，为弓形虫病的免疫预防和临床治疗新方案的设计提供理论和实验依据。复苏刚

5、地弓形虫RH株速殖子，注射接种小鼠腹腔；建立虫体与小鼠巨噬细胞（RAW264.7）细胞的共同培养体系，依次以不同比例的虫体接种细胞，观察虫体在细胞内的增殖情况，确定适宜的虫体与细胞感染比例及培养时间。以滤膜过滤法纯化体内培养和体外培养模型获得速殖子。采用吉姆萨染色、琼脂糖凝胶电泳、磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）、流式细胞技术测定DNA含量检测H2O2处理弓形虫速殖子凋亡的特征；检测凋亡过程中胞内钙离子浓度变化。RH株速殖子可在RAW264.7细胞内增殖，接种72h后细胞能完全被破坏释放出大量虫体，虫体在细胞内增殖速度和传

6、代间隔稳定、形态典型，未见毒力明显减弱。两种滤膜对体内白细VI胞清除率无明显差异，对红细胞清除效果随滤膜孔径增大依次降低，小鼠体内速殖子的回收率随着孔径增大依次升高。两种滤膜对RAW264.7细胞的清除率无明显差异,体外培养的速殖子的回收率随着滤膜孔径增大而升高，并且两者间差异有统计学意义。光镜下观察H2O2处理弓形虫后，虫体失去典型形态，活力明显下降。琼脂糖凝胶电泳测定H2O2处理速殖子后的DNA未见片段化条带，以流式细胞仪检测H2O2处理速殖子凋亡程度，发现存在凋亡，随时间增大其凋亡程度扩大。流式细胞仪分析速殖子以H2O2处理后

7、DNA含量的变化，发现H2O2组速殖子数少，DNA含量降低。测定H2O2处理速殖子过程中胞浆钙离子浓度随着时间增长以及处理浓度增高而增高。成功建立刚地弓形虫RH株速殖子体外培养模型。初步研究发现H2O2能诱导弓形虫速殖子凋亡及其过程中胞浆钙离子浓度升高。关键词：弓形虫；凋亡；过氧化氢VIITHERESEARCHOFHYDROGENPEROXIDEINDUCESAPOPTOSISINTACHYZOITESOFTOXOPLASMAGONDIIZhuYong(MajoringinPathogenicBiology)DirectedbyPr

8、ofessorQiu-linYangAbstract:Toxoplasmagondiiisthemostimportantprotozoanparasiteinhumanandanimals,whichcancauseseveredi