弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究

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1、弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究中文摘要中文摘要目的：(1)探讨弓形虫速殖子体外培养、冻存和纯化的方法，为后续开展弓形虫的相关研究提供丰富而纯化的速殖子。(2)比较5种常用弓形虫速殖子DNA提取方法，为后续实验弓形虫速殖子DNA提取筛选高效简便的方法。(3)建立和优化LAMP反应体系，为弓形虫病的诊断建立一种灵敏度高、特异性强、简单快速的弓形虫DNA检测方法。方法：(1)将弓形虫速殖子接种至Hela细胞，动态观察速殖子在Hela细胞中增殖的体外培养过程。(2)速殖子中加入7％二甲亚砜和15％的乙二醇于．76℃冻存，观

2、察6个月内两种防冻剂对速殖子的冻存保护效果。(3)比较3、5、81xm3种规格的滤膜对体内外培养的速殖子的纯化效果。(4)分别以试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚．氯仿法和盐析法提取10倍系列稀释的弓形虫速殖子DNA，通过分光光度计、琼脂糖凝胶电泳和PCR比较其效果。(5)采用环介导等温扩增技术建立了检测弓形虫DNA的方法，并对反应体系进行了优化，在此基础上进行特异性、敏感性评估，并与传统PCR进行了比较。结果：(1)弓形虫速殖子能在Hela细胞中较好的生长增殖，并且在96"--'144h增殖达到高峰，这个时间段收集速殖子产量较高，Hel

3、a细胞基本被破坏，含Hela细胞较少。(2)用7％二甲亚砜和15％的乙二醇．76℃冻存速殖子，第1个月末两者防冻效果没有明显差异(P>0．05)，第3个月末和第6个月末7％-甲亚砜的防冻效果优于15％的7．--醇(尸0．05)：对红细胞的清除率随滤膜孔径的增加而降低，三者之间具有显著差异(P<0．05)；速殖子的回收率随孔径的增加而增加，三者间具有显

4、著差异俨<0．05)。在体外培养的速殖子纯化时，3、5、8岬3种规格的滤膜对Hela细胞的清除率无差别P>0．05)，速殖子的回收率随孔径的增加而增加，三者间具有显著差异(尸<0．05)。(4)酚．氯仿法提取的DNA纯度最高，煮沸法、盐析法、直接裂解法和试剂盒法依次降低；琼脂糖凝胶电泳可检测出由直接裂解法、酚。氯仿法、盐析法提取1x106个速殖子的基因组DNA；试剂盒法、直接裂解法、煮沸法、酚．氯仿法、盐析法提取的DNA经PCR扩增可检中文摘要弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究测最少速殖子的数量依次为lxl04，无目的

5、条带，lxloz，lxl01，lxl03个。(5)通过对建立的LAMP扩增弓形虫DNA反应体系的优化，发现25m体系以1．2mMdNTPs，6mMMgS04，8UBstDNA聚合酶为佳，反应温度在63"C为佳，反应时间可根据需要选择30"---60min之间，用琼脂糖凝胶电泳检测未能发现加入环引物能加快反应温度。甜菜碱对反应影响不大。特异性评估表明仅弓形虫检测阳性。LAMP的灵敏度比常规PCR高lO倍，即每毫升可检测到个位数的速殖子数。在检测弓形虫感染小鼠组织标本时，两者特异性无差别。除琼脂糖凝胶电泳检测反应结果外，还可以通过比浊仪，离

6、心后肉眼观察沉淀及加入荧光染料后在紫外灯下观察LAMP结果。结论：Hela细胞可用于弓形虫速殖子的体外培养增殖，速殖子在加入防冻剂的情况下可在．76"C冰箱保存半年以上，可以根据后续实验选择不同孔径的滤膜用于弓形虫速殖子的纯化。经典的酚．氯仿法体取速殖子DNA纯度高，但操作比较繁琐，直接煮沸法操作方便，能满足一般实验对DNA的提取要求。本研究建立的LAMP检测弓形虫基因组DNA方法，特异性强、敏感性高、简便快速且成本低，通过不断的改进，有望成为一种新的诊断弓形虫的方法。关键词：环介导等温扩增；弓形虫；DNA提取；纯化；培养；lI作者：沈

7、海英指导老师：诸葛洪祥弓形虫速殖子DNA提取及LAMP检测弓形虫的初步研究英文摘要ExtractDNAfromToxoplasmagondiitachyzoitesandaloop—-mediatedisothermalamplificationmethodfordetectionofToxoplasmagondiiAbstractobjective：(1)ToexploretheToxoplasmagondiitachyzoitescultureinvitro，cryopreservationandpurificationmethod

8、swhichwillproviderichandpurifiedtachyzoitesforthefollowingresearches(2)TocomparefivekindsoftachyzoitesD