四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体rna影响的比较

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1、四种纯化弓形虫速殖子方法对虫体RNA影响的比较【关键词】弓形虫，病；胰蛋白酶消化法；微孔滤膜过滤法；G3滤斗；CF-11纤维素柱法　　为构建高质量的cDNA文库及在其它的一些研究中，必须在尽可能短的时间里从感染弓形虫的小鼠腹水中去除炎性细胞、腹腔细胞和红细胞，纯化弓形虫速殖子，以减少mRNA的降解。为此我们比较了四种不同的纯化方法对虫体RNA的影响，以期尽可能快地获得较纯的弓形虫速殖子，提取高质量的mRNA。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1弓形虫虫株弓形虫昆山分离株由江苏省寄生虫病研究所王崇功教授赠送。　　1.1.2试剂胰蛋白酶购自华美公司，微孔滤膜（直径3μm）

2、、G3滤斗购自上海医药工业研究院。CF-11纤维素购自an公司；其余试剂为国产分析纯。　　1.2方法　　1.2.1虫体的收集以2.0×105个速殖子腹腔接种于昆明小鼠，72h后收集小鼠腹水，3000r/min离心8min，弃上清。　　1.2.2胰蛋白酶消化法虫体中加入20倍量压积的0.25%～0.3%胰蛋白酶消化液，37℃消化30min，PBS洗两次，沉淀如上法重复消化洗涤一次。镜检记数。　　1.2.3微孔滤膜过滤法虫体中加适量PBS制备虫体悬液，过内装直径3μm微孔滤膜的滤器，收集滤出液，离心。镜检记数。　　1.2.4G3滤斗虫体悬液过G3滤斗，收集滤出液，离心，镜检。　　

3、1.2.5CF-11纤维素CF-11纤维素在PBS中4℃过夜，弃浮在上面的细颗粒，装柱约3cm高。加虫体悬液10ml，20mlPBS洗柱，收集滤出液，离心，镜检记数。　　1.2.6弓形虫速殖子总RNA的抽提分别以AGPC法抽提以上四种方法纯化的虫体总RNA［1］，75%乙醇洗涤总RNA沉淀三次后空气干燥10min，最后将总RNA沉淀溶于DEPC处理过的ddH2O中，用甲醛变性胶电泳检测总RNA［2］。　　A胰蛋白酶消化法BCF-11纤维素C1.微孔滤膜过滤法；2.G3滤斗　　图1用甲醛变性胶电泳鉴定弓形虫总RNA（略）　　可见从用胰蛋白酶消化法（见图A）纯化的虫体中抽提的总R

4、NA在甲醛变性胶上呈弥漫一片，分子量偏小，说明RNA有降解。从用CF-11纤维素（见图B）、微孔滤膜过滤法（见图C1）和G3滤斗（见图C2）纯化的虫体抽提的总RNA在甲醛变性胶上可见28srRNA和18srRNA两条带，28srRNA的条带明显比18srRNA带亮，说明RNA没有降解。　　3讨论　　提纯弓形虫的方法较多，各有优缺点［3］。胰蛋白酶消化法能破坏细胞，使胞内虫体释出，虫体回收率达140%，白细胞的清除率也高，可用于大量制备抗原。但所需时间长，工作量大，对mRNA的质量有影响，不适于cDNA文库的构建。微孔滤膜过滤法虽然能使虫体纯度最高，但回收率太低，且存在滤膜易破

5、、分离量少等缺点，可能与膜的质量有关。G3滤斗法快速，但虫体的纯度不够，也可能与我们所购G3滤斗的孔径标准有关。CF-11纤维素法具有快速简单、纯度高等优点，虽然红细胞清除率低，但红细胞没有细胞核，对弓形虫mRNA的抽提影响不大。所以该法较适用于cDNA文库构建时虫体的分离纯化［4］。【参考文献】　　［1］PiotrChomczynskiandNicolettaSacchi.Single-StepmethodofRNAisolationbyacidguanidiniumthiocyanate-penol-chloroformextraction［J］.AnalyticalBi

6、ochemistry1987，162:156-159.　　［2］LehrachH，D.DiamondJM，olecularinationsbygelelectrophoresisunderdenaturingconditions，acriticalreexamination［J］.Biochemistry，1977，16:4743.　　［3］RobertP，Dempster.Toxoplasmagondii:purificationofZoitesfromperitonealexudatesbyeightmethods［J］.Experimentalparasitology，

7、1984，57:195-207.　　［4］杨秋林，陆惠民，邬敏辰，等.弓形虫昆山分离株速殖子期表达型cDNA的构建及鉴定［J］.中国人兽共患病杂志，2000，（10）：25-27.