弓形虫rh株速殖子cdna文库构建、免疫学筛选及阳性克隆鉴定

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1、安徽医科人学顺士学位论文／缘7等2005英文缩写AmpbocDNAdNTPdot．ELISAE．coliHRPDABlPTGLBKanaKDLD．PCRNCODORFPBSPCRrpmX-gal中英文词对照表英文全称AmpicillinBasepairComplementaryDNA中文名称氨苄青霉索碱基对互补DNADeoxyr

2、bonucIeosjdetriphosphate三磷酸脱氧核糖核苗Dot-enzyme‘linkedimmunosorbentassay斑点ELISAEscherichiacoIHorseradishperoxidase大肠杆菌辣根过氧化物酶Diamin

3、obenzidine二氨基联苯胺lsopropylthio·B·D—galactopyranoside异丙基硫代．B—D-T'qL糖营Luria-BeganimediumKanamycinKilodaltonLong-distancePCRNitrocellulosefilterOpticaldensityOpenreadingframePhosphate·bufferedsalinePolymerasechainreactionRevolutionperminuteL13培养基}那霉素千道尔顿氏距离PCR硝酸纤维素滤膜光密度开放阅读框磷酸盐缓冲液聚合酶链反麻每分钟转速5一溴．4

4、．氯．3．吲哚．§一D一半乳糖‘岢6安徽医科大学硕士学位论文壬淼传2005中文摘要目的：构建弓形虫RH株速殖子eDNA文库并用慢性感染的小鼠血清对其进行免疫学筛选，以寻找有效的疫苗候选分子和早期诊断弓形虫病的试剂。方法：收集、纯化弓形虫RH株速殖予，提取总RNA，逆转录生成eDNA，PCR合成eDNA双链。经过纯化、sfiAB酶切、过柱除去小片段后，与^TriplEx2噬菌体载体两臂连接包装后形成弓形虫RH株速殖子eDNA文库。收集成囊株(Prugniaud株)慢性感染的小鼠血清，经滤膜吸附法去除血清中的大肠杆菌抗体，用以筛选弓形虫Rll株速殖子eDNA文库。对3次复筛得到的阳性

5、克隆进行插入片段的核苷酸序列测定，结果送GenBank进行同源性分析。根据序列测定结果，选取其中一个具有完整开放阅读框架的基因进行分析。结果：初始文库的容量为7．8×106个重组子，经感染XLl一Blue菌扩增后，文库的滴度达10“’pfu／ml。任意挑取克隆经自身环化后提取质粒，酶切后片段大小范围为400—1200bp，重组率90％以上。用抗血清初筛了约7．2×104个重组的噬菌体，得到38个阳性克隆，对其中15个阳性克隆经过三次复筛，得到4个持续阳性反应克隆。通过对四个克隆进行测序并经同源性分析发现，wTl克隆基因为弓形虫P30基因；WT4克隆基为弓形虫N一乙酰磷酸丙糖转移酶

6、基因；WT9克隆基因与现在已知的基因无同源性；WTl2克隆基因与一未知的弓形虫基因有很高的同源性，且具有一个513bp大小的完整的开放阅读框架，通过对其蛋白质结构和功能预测，它可能是一个跨膜信号蛋白。结论：本试验成功地构建了弓形虫RH株速殖子eDNA文库，筛选所得到的阳性克隆有望成为早期诊断抗原或保护性疫苗分子，值得进一步研究。关键词：弓形虫cDNA文库免疫学筛选阳性克隆分析墨堕垦翌查兰堂垡堡兰墅堂!鲨ConstructionandhnmunoscreeningofthecDNALibraryofToxoplasmagondiandAnalysisofthepositivecol

7、onesObjective：ConstructingaeDNAlibraryofToxoplasmagondiitachyzoitestage(RHstrain)．andscreeningitusingseralofmouseinfectedwithbradyzoites(Pmgniandstrain)inordertolookfornewvaccinemolecularandearlierperioddiagnosisreagents．Methods：rgondiitachyzoitestage(RHstrain)werecollected．TotalRNAwasextract

8、edfromrgondiitachyzoitestageandcDNAwassynthesizedbyRT-PCR．TheeDNAwasrecombinantorientedintophagevectorwithsfiA．Badaptor．AToxoplasmaeDNAlibrarywasconstructedafterpackaging．Theseralofmouse(Pmgniaudstrain)werecollectedandeliminatedanti—E-coliant