豚鼠脑基底动脉平滑肌cdna文库构建及筛选

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1、豚鼠脑基底动脉平滑肌eDNA文库的构建及筛选硕士研究生：刘利群指导教师：李淑媛教授专业名称：药理学摘要目的：肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainl【in勰eMLCK)能够磷酸化肌球蛋白(myosin)的20kDa轻链，磷酸化的mosin与肌动蛋白(actin)相结合，引起肌肉收缩，MLCK对于肌肉的收缩和松弛有重要的调节作用。多种哺乳动物及少数无脊椎动物的MLCK基因已经被克隆，但豚鼠(guineapig)的MLCK基因至今为止尚未被克隆。本实验旨在从GBaSM一4细胞株(guineapigbasalanerysmoothmusclec

2、ellline)构建cDNA文库并筛选豚鼠smMLCKcDNA，为其进一步应用打下基础。方法：培养GBaSM．4细胞至所需数量，提取RNA后反转录合成eDNA，再与ZAPExpressVector相连，扩增文库后测定效价，并鉴定重组子插入片段大小。再以MLCK序列保守性为依据合成的MSF，M6R为引物，单链cDNA为模板，FOR扩增探针，测序后标记。重复筛选cDNA文库直至可以挑取单个阳性克隆并提取质粒，测序后与GenBalll【数据库做序列同源性比较。，一＼结果：raRNA总量为24肚g，A。与A。的比值为2．044，说明mRNA足够纯净，且量足够

3、，符合建库要求。重组子插入片段平均大小>lkb，cDNA文库扩增后的效价为6．7X106pfu／ml，达到了高质量文库的要求。以MSF，M6R为引物所得到的FCR产物，测序结果长1833bp，编码6ll个氨基酸，为豚鼠smMLCK的一部分，GenBank收录号为AB070227。筛选eDNA文库后，随机选择4个阳性克隆测序后同源性均在93％以上，说明这4个样品为相同序列，长度为2349bp，编码782个氨基酸，包括催化域，调节域及肌球蛋白结合域。测序结果与GenBank中兔，人，牛，鸡的91．52％，结论比较，同源性分别为95．76％，95．63％8

4、33bp的豚鼠smMLCKeDNA片段，序列被GenBank收录。又用豚鼠脑基底动脉平滑肌细胞，成功构建了高质量的eDNA文库，并从此文库中，成功地筛选得到长度为2349bp的豚鼠smMLCKeDNA片段的克隆，测序结果与兔，人，牛，鸡的smMLCK的催化域，调节域及肌球蛋白结合域的核苷酸序列有高度的同源性，说明了这些哺乳动物和鸡的smMLCK的这些区域核营酸序列的高度保守性。对豚鼠smMLCK全长eDNA序列的最后确定则有待于进行下一步的研究工作。关键词肌球蛋白轻链激酶cDNA文库豫筛选嗣源ConstructionandScreeningofGui

5、neaPigBasalArterySmoothMuscleeDNALibraryPostgraduate：LiqunLiuSupervisorprofessor：ShuyuanLiProfession：PharmacologyAbs仃actobjective：Myosinlightchainldnasc州LCK)canphosphorylate20kDamyosinlightchainandphosphorylatedmyosininteractswithaetintoinducemusclecontraction．SoMLCKhasregulato

6、ryeffectonthecontractionandrelaxationofmuscle，ManymammalianandafewinvertebrateMLCKgeneshavebeencloned,butGuineapigMLCKgenehasnotbeencloneduntilnow．TheaimofthepresentresearchistoconstructeDNAlibraryfromguineapigbasalarterysmoothmusele(GBaSM-4)cellline，SCre口lguineapigsmMLCKgenean

7、dfoundthebasisforitslaterUSe．Methods：WhentheamountofGBaSM-4cellsWaSenough,RNAWaSextractedandeDNAwassynthesizedbyRT-PCR．ThandsDNAWaSligatedtoZAPExpressVector．Afteramplificationandtitering，insertedfragmentswereanalyzed．eDNAusedforpmbewasamplifiedbyPCR．usingM5FandM6Rasprimers，whic

8、hweredesignedonthebasisoftheconservativedomainofMLCK．T