轮状病毒vp4抗原表位在vp6载体蛋白同一位点表达比较研究

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1、，也京碱如皆聲悅中＠每５钟每化硕±研究生学位论文北京协和医学院研究生院学校代码；１００２３学号：巧０１２０１８０１８硕±学位论文轮状病毒ＶＰ４抗原表位在ＶＰ６载体蛋白同一位点表达比较研究ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｗｏｒｏｔａｖｉｒｕｓＶＰ４ｅｐｉｔｏｐｅｓｃａｒｒｉｅｄｏｎｔｈｅｓａｍｅｓｉｔｅｏｆＶＰ６ｖｅｃｔｏｒｒｏｔｅｉｎｐ所院；医学生物学研究所巧名；夏文跃指导教师；陈元鼎研究员导师小组：文喻玲副主任技师学科专业：病原生物学研究方向；分子病毒学及基因工程疫苗

2、一完成日期：二零五年五月目录摘要１ＡＢＳＴＲＡＣＴ２前言３实验材料和方法９一＞实验材料９１．主要仪器９２．主要试剂１０３．菌毒株，载体质粒，细胞和实验动物１０二．实验方法１１１．构建Ｐ盯Ｐ６重组质粒并盜定１１１．１合成引物１１１－．２ＴＢＣｈｅｎ株ＲＶＶＰ６全编码基因组的ＰＣＲ扩增舊．１２１．３回收ＰＣＲ扩增产物１２１．４制备连接片段并进行连接和转化１２１．４１连接片段的制备１２１．４２ＶＰ６基因与ｐＥＴＬ载体酶切片断连接１３１．４３连接反应产物转化ＤＨ５

3、ａ感受态细胞１３１．５重组表达质粒ＰＥＴＰ６的制备及鉴定１４１．５１碱裂解法小量制备质粒ＤＮＡ１４１．５２Ｗｄｅｌ／ＳｏｍＨＩ酶切鉴定重组表达质粒．１１４１．５３大量制备质粒ＤＮＡ１４１．５４核巧酸序列测定巧２打Ｐ６Ｖ载体质粒的构建及鉴定化Ｐ２．１携带５０ＣＩＩ酶切位点的载体质粒制备及鉴定１６２．１１携带Ｓ曰ＣＩＩ酶切位点的插入片段的制备化２．１２载体片段制备１７２．１３插入片段与载体质粒酶切片段的连接１７２．１４连接反应产物转化ＤＨ５ａ大肠巧菌细胞化２．巧碱裂解法小量制备质粒ＤＮＡ化

4、２．１６酶切鉴定重组表达质粒ｐＥＴＰ６ｖａｃＩＩ化＾）２．１７大量制备质粒ＤＮＡ化２．１８核巧酸序列测定１８３．含有ＶＰ６蛋白基因不同位置上带有不同酶切位点的ｐＥＴＰＧｖ载体质粒的构建１９４．携带ＲＶＶＰ４抗原表位重组表达质粒ＰＥＴＰ６口９化／Ｐ间２９６和ｐＥＴＰ６口９８Ｓ／Ｐ脚３８１的构建及鉴定巧４．１外源抗原表位（Ｐ２９６Ｐ３８１）１９间，脚的设计４．２引物互补片段的制备２０４．３载体质粒打Ｐ６Ｆ酶切片段的制备２０Ｐ４．４插入片段和载体质粒ＰＥＴＰ６Ｖ酶切片段的连接及转化２０４．５连接反应产物转化

5、ＤＨ５ａ大肠杆菌细胞２１４．６碱裂解法小量制备质粒ＤＮＡ２１４．７酶切鉴定重组表达质粒２１４８大ＤＮＡ２１．量制备质粒４．９核昔酸序列测定２１５．重组ＶＰ６Ｆ载体蛋白和重组嵌合蛋白６Ｆ／Ｐ巧１巧６，６Ｆ／Ｐ脚３８１在大肠杆菌中的表达２１６．重组载体蛋白（ｒＶＰ６ｖ）和重组嵌合蛋白的纯化２２７．Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定纯化蛋白的浓度２２８．ＭＡ１０４细胞复苏与传代培养２３８．１ＭＡ１０４细胞的复苏２３８．２ＭＡ１０４细胞的传代培养２３９－ＲＶ增殖２３，收获１０．ＲＶ的纯化２４１１．动物免疫及

6、血清抗体的制备２４１１．１实验动物分组２４１１．２免疫方案２４１２．微量滴定法测Ｗａ病毒感染性滴度巧１３．重组ＶＰ６Ｆ载体蛋白和重组嵌合蛋白ＰＥＴＰ６口９８Ｓ／Ｐ［８］／２９６和Ｐ打Ｐ６口９８Ｓ／Ｐ［８］／３８１免疫豚鼠血清中和抗体效价的检测巧１４．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测纯化的重组嵌合蛋白的免疫原性巧结果与分析２６１质粒的构建２６１．１ＶＰ６基因的扩增２６１．２携带ＲＶＶＰ６基因的重组表达质粒打Ｐ６的构建及整定２７Ｐ１．３携带外源抗原表位的重组表达质粒ＰＥＴＰ６巧９８Ｓ／Ｐ脚／２９６和ｐＥＴＰ６Ｆ２

7、９８ＳＰ８３８１２７／［］／的构建及鉴定２重组嵌合蛋白在化２１ＤＥ３中的表达和纯化２８（）３纯化蛋白浓度的测定巧４ＲＶ病毒感染性滴度的测定和免疫动物血清中和抗体滴度测定３０５Ｗｅ巧ｅｒｎｂｌｏｔ分析３１讨论３３小结３６参考文献３７臟４１一（）缩略词４１（二）主要溶液配方４２（Ｈ）主要实验步骤５０（）ＲＶＴＢ－Ｃｈｅｎ株ＶＰ６编巧基因核巧酸序列及氨基酸序列四５８致谢６０贼生简历６１独创性声明的