赤点石斑鱼神经坏死病毒现场快速核酸检测方法的建立与应用

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1、学校代码：10264研究生学号：M120101016上海海洋大学硕士学位论文赤点石斑鱼神经坏死病毒现场快速核酸检测题目：方法的建立与应用TheEstablishmentandApplicationofOn-site英文题目：andRapidDetectionMethodsforRed-spottedGrouperNervousNecrosisVirus专业：水产养殖研究方向：水产养殖动物疾病诊断姓名：粟子丹指导教师：史成银研究员二O一五年五月二十日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。

2、所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，

3、可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日i赤点石斑鱼神经坏死病毒现场快速核酸检测方法的建立与应用TheEstablishmentandApplicationofOn-siteandRapidDetectionMethodsforRed-spottedGrouperNervousNecrosisVirus学位论文完成时间：__________________指导教师签字：______________

4、____答辩委员会签字：______________________________________________________________________________________________________________________________ii赤点石斑鱼神经坏死病毒现场快速核酸检测方法的建立与应用摘要神经坏死病毒（nervousnecrosisvirus,NNV)是多种海水养殖鱼类的病原，容易感染稚鱼和幼鱼。其导致的病毒性神经坏死病死亡率高，给养殖业带来了巨大的经济损失。对该病的治疗还

5、没有有效的药物和疫苗，因此开发简便、灵敏度高、特异性强的快速检测NNV的方法非常重要。本文针对赤点石斑鱼神经坏死病毒，设计了特异性引物，建立了交叉引物等2+温扩增体系，并对该方法的Mg浓度、dNTPs浓度、反应温度三个重要参数进行了优化。优化后的反应体系为：5mmol/LMgCl2、1.2mol/LBetaine、1.2mmol/LdNTPs、1.6μmol/L引物1a、0.8μmol/L引物2a/3a、0.2μmol/L引物4s/5a、10×ThermoPolBuffer2.5μL、WarmstartBstDNA聚合酶

6、8U、M-MLV反转录酶28U以及适量的RNA模板，DEPC水补足至25μL。优化后的反应参数为69ºC保温60min，然后80ºC保温5min终止反应，最后采用切向流试纸条通过肉眼判断检1测结果。该方法的检测极限为10copies/µLRNA模板,比常规RT-PCR高10倍，与荧光定量RT-PCR灵敏度相当。该方法反应特异性良好，与病毒性出血性败血症病毒（VHSV）、传染性胰脏坏死病毒（IPNV）、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、淋巴囊肿病毒（LCDV）、哈维氏弧菌(Vibrio.harveyi)、鳗弧菌(V.an

7、guillarum)等多种鱼类病原均无交叉反应。使用该方法对实际样品进行检测，与LAMP试剂盒方法相比较，更容易分辨阴性和弱阳性。本实验所建立的赤点石斑鱼神经坏死病毒交叉引物等温扩增联合切向流试纸条方法（CPA-LFD）简单、快速、灵敏度高且特异性强,可以广泛用于疾病的现场快速诊断。近年来，表面增强拉曼光谱（SERS）用于基因的检测越来越受到研究者们的关注。本研究还为快速检测鱼类神经坏死病毒，设计了病毒特异性的发夹型探针，iii上海海洋大学硕士学位论文经硫醇修饰后与纳米银溶胶结合，制备了鱼类神经坏死病毒纳米探针（Ag-N

8、NV），并使用透射电镜、多功能酶标仪、表面增强拉曼光谱仪等对纳米探针Ag-NNV的表征及发夹型探针在纳米银粒子表面的覆盖率进行了测定和分析。结果表明，裸露的纳米银粒子为球形，平均直径50nm；制备的纳米探针颗粒为球形，平均直径90nm。纳米银粒子和纳米探针在溶液中均具有良好的分散性。平均每个纳米银粒2子表面结合发夹型