神经坏死病毒在患病赤点石斑鱼稚鱼组织中分布

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1、神经坏死病毒在患病赤点石斑鱼稚鱼组织中分布　　病毒性疾病严重危害我国水产养殖业的健康发展,近年来我国学者报道了不少新生病毒性疾病,其中病毒性神经坏死症(Viralnervousne-crosisvirus,VNN)是一种在世界范围内流行的鱼类疾病。VNN流行在中国、日本、澳大利亚、英国、加拿大、挪威等国家,可造成30多种重要经济鱼类的大规模死亡,严重危害着鱼类养殖业,因此该病毒是国际水产病害研究的热点。神经坏死病毒分类上属于野田病毒科(Nodaviridae),乙型野田病毒属(Betanodavirus)。病毒粒子直径约3040nm

2、,二十面体,无囊膜,由衣壳和两条正单链RNA基因组RNA1和RNA2组成。其中RNA1编码病毒RNA聚合酶和非结构蛋白B2。RNA2编码病毒唯一的衣壳蛋白。在光学显微镜下,患病鱼类在脑部和视X膜有明显空泡,故又称病毒性脑膜炎和视X膜病。　　在透射电镜下可观察到患病鱼脑、视X膜细胞质中存在大量病毒粒子。　　神经坏死病毒严重危害我国经济鱼类,特别是石斑鱼的养殖。2001年中国率先报道了赤点石斑鱼Epinephelusakaara病毒性神经坏死症,随后开展组织病理、流行病学、衣壳蛋白的克隆和表达、全基因组测定等研究。我国其他学者也做大量研

3、究,主要包括病理学,RT-PCR检测方法、全基因组测定、流行病学、免疫保护、致病性、新细胞株建立、基因干扰载体等。地高辛杂交和免疫荧光检测技术可分别检测病毒核酸和蛋白在患病组织中的分布,为病毒的感染和复制提供重要信息。至今为止国内还缺乏此类基础资料。我们团队曾建立地高辛标记DNA探针原位杂交技术;本文采用地高辛标记DNA探针和NNV衣壳蛋白特异性抗体,研究NNV核酸和蛋白在患病赤点石斑鱼稚鱼组织中分布,探讨了此病毒的感染途径和复制位点,为防治此病提供基础资料。　　1材料与方法　　1.1试验材料　　赤点石斑稚鱼为广东省大亚湾水产试验中

4、心所生产,全长0.30.5cm,孵化后20d30d。患病鱼苗体弯曲、体色较黑、身体失衡、浮于水面、间或螺旋状游动,为典型病毒性神经坏死病症状(图1)。　　用赤点石斑神经坏死病毒特异性引物对稚鱼脑部总RNA做RT-PCR检测,患病鱼样品呈阳性,健康鱼样品呈阴性。　　　　1.2组织切片　　用10%中性福尔马林固定稚鱼。鱼苗先经透蜡固定,然后在70%的酒精中处理2h,80%酒精中2h,90%酒精中2h,95%酒精中1h,100%酒精中1h,100%酒精中3次每次0.5h,酒精和二甲苯比例为3︰1溶液中0.5h,纯二甲苯中2次每次0.5h,

5、58℃石蜡中透蜡2h,然后将样品和石蜡置于冰上,降温凝固。将透蜡固定后的组织进行切片,厚度为0.40.5μm,自然风干。　　1.3PCR引物名称和序列　　根据神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列(NC008041.1)设计三条引物:F1(5′-GGATTTGGACGTGCGACCAA-3′),R3(5′-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3′),F2(5′-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3′)。其中F1和R3用于扩增RNA2编码衣壳蛋白的T2片

6、段(875bp),F2和R3用于扩增RNA2编码衣壳蛋白的T4片段(426bp)。T2片段的3′和T4片段完全重叠。　　1.4地高辛探针制备　　取患病鱼苗的头部(包括眼睛),用TRIZOL(LifeTechnologies)RNA抽提试剂盒,按照使用说明进行RNA抽提。用F2-R3引物合成T4片段来制备地高辛探针。先将提纯的RNA在沸水中煮5min,然后置于冰上5min。取1μL上述RNA,加入事先配制好的逆转录反应液中,每一反应液含有(5Firststrandbuffer2μL,0.1mol/LDDT1&m

7、u;L,2.5mmol/LdNTPmixture4μL,R3引物(20pmol)0.5μL,核酸酶抑制剂(LifeTechnologies)0.1μL,SUPERSCRIPTTMⅡ逆转录酶(LifeTechnologies)0.2μL,焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的蒸馏水1.2μL),在42℃中反应30min,99℃中10min灭活逆转录酶。将上述逆转录反应产物稀释70倍,采用BoehringerMannheim公司生产的地高辛试剂盒(DIGDNALabelingandDetectionKit)生产探

8、针。PCR反应液:vial3buffer5μL,vial2buffer5μL,引物F2(20pmol)0.5μL,引物R3(20pmol)0.5μL,vial1(聚合酶)0.75μL,稀释的逆转录产物5&