小鼠肝炎病毒核酸快速检测方法的建立和应用-论文.pdf

《小鼠肝炎病毒核酸快速检测方法的建立和应用-论文.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、第3O卷第4期实验动物科学Vo1．3ONO．42013年8痧驴月告报究研驴《》LAB0RATORYANIMALSCIENCEAugust2013小鼠肝炎病毒核酸快速检测方法的建立和应用熊炜蒋静张强刘俊平魏晓锋黄忠荣李健胡建华(1．上海出入境检验检疫局，上海200135)(2．上海实验动物研究中心，上海201203)摘要：为满足口岸对入境噬齿类动物快速检疫的需要，建立小鼠肝炎病毒(Mousehepatitisvirus，MHV)快速核酸检测方法。方法使用引物和TaqMan荧光探针设计软件，针对MHV保守

2、基因设计引物和探针，建立了RT—PCR和Real—timeRT—PCR方法检测噬齿类动物临床样本中MHV的方法。结果本研究建立的RTPCR和Real—timeRT—PCR检测MHV方法具有良好的特异性和敏感性，通过将建立的方法应用于MHV阳性鼠临床样品的检测，证实两种MHV核酸检测方法具有良好的稳定性。结论本研究建立的RT—PCR和Real—timeRT—PCR检测MHV的方法，适用于动物粪便、尿液等易于获得样本的检测。关键词：小鼠肝炎病毒；RT—PCR；Real—timeRT—PCR中图分类号：Q9

3、5—33文献标识码：A文章编号：1006—6179(2013)04-0001-05小鼠肝炎是由小鼠肝炎病毒(Mousehepatitisvirus，MHV)引起鼠的一种高度传染性疾病，1材料和方法MHV呈世界性分布，无明显的季节性，通常情况下，大多数带毒鼠呈隐性感染，但与某些微生物1．1主要试剂发生混合感染时，或在环境条件的刺激下常会爆TRIzol购自Invitrogen公司，Taq酶、AMV逆转发疾病，是啮齿类动物最难清除的病毒之录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物、DNAMarker一(DL2

4、000)购自Takara公司。。MHV可经消化道和呼吸道途径感染，病1．2病毒样品来源及处理鼠可通过粪便、鼻咽液、尿液向环境排毒，因此，MHV阳性小鼠和MHV细胞培养物来自上海实直接接触病鼠粪便或其污染的垫料是MHV主要验动物研究中心，病鼠采集尿液、粪便，以及肝、脾、的传播途径。MHV属于冠状病毒科冠状病肺、肾等组织器官。粪便或组织样品加等体积生理毒属(Coronavirus)，是一个单股正链RNA病盐水研磨匀浆，3000g离心15min，收集上清液待毒。除采用病毒分离、血清中和、间接ELISA检。本

5、研究使用的其他病毒，如小鼠肺炎病毒等血清学检测方法外，RT—PCR是检测MHV最常(Pneumoniavirusofmice，MPV)、仙台病毒(Sendai用的方法。近年，有报道采用环介导等温扩增方virus，SV)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒法(LAMP)和金标法检测MHV。为了加强(LymphocyticChoriomeningitisvirus，LCMV)、呼肠孤口岸对入境噬齿类实验动物和野生动物MHV疫病毒3型(Reovirustype3，Reo一3)、小鼠细小病毒病监测和流行病学调查的需要，

6、本研究建立了(Parvovirusminutevirusofmice，MVM)来自上海实RT．PCR和Real—timeRT—PCR检测MHV的方法，验动物研究中心；猪传染性胃肠炎病毒(Porcine并对方法的特异性、敏感性和稳定性进行了transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)、牛冠状病验证。毒(Bovinecoronavirus，BCV)、犬冠状病毒(Caninecoronavirus，CCV)、猫传染性腹膜炎病毒(Feline收稿日期：2013—06—26’基

7、金项目：上海市科委科研项目(No．11140901100和13DZ0502500)作者简介：熊炜(1974一)，男，博士，高级兽医师。研究方向：病毒检测和分子生物研究。通信作者：蒋静(1979一)，女，硕士，高级兽医师。研究方向：实验动物疫病检测。·2·实验动物科学3O卷infectiousperitonitisvirus，FIPV)为本单位引进保存物和探针的浓度均为25~mol／L。毒株。上述病毒样品经核酸分离提取制备成DNA1．7Real-timeRT-PCR检测或cDNA备用。采用ABI公司Vi

8、iA7荧光PCR仪。反应体系1．3动物攻毒实验为：10倍Taq酶浓缩缓冲液2．5L、dNTP0．5L、将MHV细胞培养物1mL灌入2周龄的Balb／cTaq酶0．25IxL、模板1L、上下游引物(TMHVF、小鼠胃内，正常喂饲数日，待其出现明显临床症状后TMHVR)各0．25IxL、TaqMan探针0．25L，加水补采集小鼠的粪便，处死后采集肝、脾、肺、肾及膀胱中足总体积至25L。反应条件为：首先95℃3min；的尿液。然后95℃15S，59oC45S，