罗非鱼无乳链球菌lrrg-sip融合蛋白的制备及其免疫保护作用研究

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1、学校代码：10264研究生学号：M120101040上海海洋大学硕士学位论文罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白的制备及中文题目：其免疫保护作用研究PreparationandImmune-protectiveeffectofLrrG-SipFusionProteinagainstStreptococcus英文题目：agalactiaeofTilapia专业：水产养殖研究方向：水产健康养殖姓名：曾祖聪指导教师：卢迈新研究员二O一五年六月日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得

2、的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文

3、作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注张其中暨南大学教授主席中国水产科学研究董在杰院淡水渔业研究中研究员委员心中国水产科学研究朱新平研究员委员院珠江水产研究所委员委员委员中国水产科学研究刘志刚助理研究员秘书院珠江水产研究所珠江水产研究所科2015年6答辩地点答辩日期技楼一楼会议室月2日上海海洋大学硕士学位论文罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白的制备及其免疫保护作用研究摘要无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，又称为B群链球菌(GroupBstreptococcus，GBS)，

4、革兰氏阳性菌，可导致多种动物（水生动物、哺乳动物）患病及人类多种疾病。近年来，中国罗非鱼养殖主产区暴发了严重的无乳链球菌病，冲击了中国罗非鱼产业的发展，经济损失严重，阻碍了中国罗非鱼产业的健康发展。抗生素治疗罗非鱼无乳链球菌病是目前采用的主要方法，但是抗生素的不合理使用会增加病原的耐药性。疫苗因具有高效、安全、无残留等特点是预防罗非鱼无乳链球菌病的潜在有效手段之一，也是目前研究的热点。无乳链球菌表面免疫原性蛋白LrrG（Leucine-richrepeatproteinfromGBS）和Sip（SurfaceImmunogenicProtein）存在于各种血清型菌株中，高度保

5、守，两者在抗罗非鱼无乳链球菌病方面均具有良好的免疫保护作用。有研究表明将两个或两个以上免疫原性基因融合，表达出的融合蛋白的免疫原性要优于单一蛋白。本研究试图将罗非鱼无乳链球菌的两个免疫原性基因LrrG和Sip融合后表达，获得LrrG-Sip融合蛋白，探讨该融合蛋白能否提供更好的免疫保护率。本研究首先根据序列分析，设计引物，扩增罗非鱼无乳链球菌的表面蛋白LrrG和Sip基因，然后利用双酶切技术将基因LrrG和Sip串联，中间添加具有生物学保护功能的疏水性多肽接头(Gly4Ser)3linker序列，最后插入到原核表达载体pColdII中，构建原核表达载体pColdII-LrrG

6、-Sip，转入感受态细胞BL21(DE3)，经过表达条件优化，成功诱导表达获得了LrrG-Sip融合蛋白，并将纯化的融合蛋白注射免疫尼罗罗非鱼（Oreochromisniloticus）。主要研究内容与结论如下：1．罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合基因原核表达载体的构建及表达提取无乳链球菌基因组DNA，查找目的基因LrrG、Sip全基因序列，相关软件分析目的基因序列，结合原核表达质粒pColdⅡ酶切位点和基因序列酶切位点设计引物。为使融合蛋白的生物活性尽量接近天然蛋白，在Sip上游引物中添加具有生物学保护功能的疏水性多肽接头(Gly4Ser)3linker序列。鉴于Lrr

7、G、Sip基因较大，通过重叠延伸PCR技术容易带来碱基突变，本研究采用基因拼接技术中的双酶切法分两步逐个将Sip和LrrG基因插入pColdII载体中，构建原核表达载体pColdI上海海洋大学硕士学位论文II-LrrG-Sip。将成功构建的融合基因原核表达载体转化感受态细胞BL21(DE3)，SDS-PAGE显示该融合蛋白以可溶和包涵体2种形式存在。通过控制变量的方法分别研究了IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对融合蛋白表达的影响，进行了诱导表达条件的优化。结果显示在15℃、IPTG0.5mmol·L-1