罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究

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1、罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究张新艳，樊海平，钟全福，卓玉琛，林煜，曾占壮（福建省淡水水产研究所，福建福州350002）摘要：从患暴发性流行病罗非鱼的肝脏中分离获得一株细菌TL60829NA；将TL60829NA对罗非鱼进行人工感染致病性试验，试验感染罗非鱼表现出自然发病症状，确认分离菌株为罗非鱼暴发性流行病的致病菌。分离株菌经形态学观察、BioMerieuxVitek全自动微生物分析系统GPI测定卡分析和16SrRNA特异性基因序列与NCBI中收录的其它引起罗非鱼病害的链球菌的16SrDNA序列构建的系统发育进化树显示，分离细菌与其它无乳链球菌的1

2、6SrDNA序列构成一个进化分支，而海豚链球菌则构成另一分支，确定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcusagalaciate)。分离菌株对氨苄西林、青霉素G、卡那霉素等28种试验药物敏感，对妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星等15种试验药物不敏感。由无乳链球菌引起的罗非鱼暴发性流行病的主要病理变化为鳃小片结构崩解，鳃上皮增生、融合；心肌纤维变性、肌间白细胞浸润；肝脏颗粒变性和脂肪变性；肠道粘膜上皮变性、坏死、脱落、固有膜炎性白细胞浸润；肾脏组织大量嗜中性白细胞浸润，肾小管上皮细胞核固缩，小动脉血管壁玻璃样变性；眼睛的脉络膜和眶骨膜组织炎性坏死，晶状体纤维

3、断裂和脱离。关键词：罗非鱼；无乳链球菌；致病性；细菌鉴定；药物敏感；组织病理中图分类号：文献标识码：A文章编号：近年在福建、广东、海南等省的养殖罗非鱼中暴发一种流行病，病鱼主要症状为：体色发黑，临死前于水面打转或间隙性窜游，部分病鱼眼球突出或混浊发白，腹部体表具点状或收稿日期：2007-11-28基金项目：福建省海洋与渔业科技项目(闽海渔科06214号)作者简介：张新艳，（1980-），女，福建永泰人，硕士，从事水产养殖动物病害研究。TeL：0591-83732002，E-mail：swallowz47@163.com通讯作者：樊海平TeL：0591-8379

4、6968，E-mail：fanhaiping@tom.com12斑块出血或溃疡，鳃盖内侧出血，肝脏、胆囊、脾脏肿大，严重时糜烂，肠道和胃积水或积黄色粘液。流行于春、夏和秋季，流行高峰为5～9月，流行水温25℃～37℃，主要危害亲鱼及100g以上的幼鱼和成鱼，传染性强，发病率达10%～30%，死亡率达25%～80%，造成了严重的经济损失。本暴发性流行病的主要症状和流行情况与国内报道的罗非鱼海豚链球菌(Streptococcusiniae)病相似[1－3]，但国外报道罗非链球菌病的病原主要有无乳链球菌(S.agalaciate)和海豚链球菌[4]。本文报道由无乳链

5、球菌引起的养殖罗非鱼暴发性流行病的病原菌分离、鉴定和致病性等研究结果。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验用鱼2006年8月，自广州鹭业水产公司狮岭罗非鱼养殖场采集具暴发性流行病典型症状的病鱼；试验用健康罗非鱼取自福建省淡水水产研究所融桥中试基地的健康罗非鱼(Oreochrimisniloticus×Oaureus)，体重为150±10g。塑料袋充氧运回实验室，于水族箱暂养5d，暂养期间不投饵，连续充气，水温25℃～28℃，稳定后1周后供人工感染用。1.1.2培养基、试剂、药敏纸片营养肉汤培养基、脑心浸液培养基（BHI）购自北京陆桥公司产品；血琼脂、胰蛋白

6、胨、酵母浸粉、琼脂糖购自厦门泰京生物技术公司；Taq酶、10×PCR缓冲液、dNTP、pMD-18T载体、DNAMarkerDL2000购自大连宝生物（Takara）公司；胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞、无Dnase/Rnase水购自TIANGEN公司；引物fD1（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'），rD1（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）由上海鼎安测序公司合成；药敏纸片购自北京天坛中国药品生物制品检定所。1.2试验方法1.2.1涂片检查病原体　　以无菌器具解剖病鱼，分别取鳃、肝脏、肾脏、脾脏、性腺、眼球等器官的

7、小块组织，于洁净载玻片涂片，风干后，革兰氏染色，于OlympusCX41油镜下检查。1.2.2病原菌的分离、纯化　　取活的具典型症状的病鱼，无菌生理盐水冲洗体表三遍，无菌解剖后，无菌接种环自肝脏、肾脏和体表溃疡处取样，BHI培养基平板划线涂布，28℃恒温培养36h～48h后，挑取形态一致的优势单菌落进一步划线纯化，直至获得纯培养物12后，接种营养肉汤液体培养基，28℃恒温培养48h，加无菌甘油后，-80℃保存备用。1.2.3人工感染试验取-80℃保存的试验用菌株接种BHI平板，28℃培养24h，无菌生理盐水洗下培养物并10倍梯度稀释成不同浓度的菌悬液，腹腔注射

8、暂养稳定后的试验用健康罗非鱼，每尾注射