罗非鱼无乳链球菌免培养快速检测方法的研究

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1、硕士学位论文罗非鱼无乳链球菌免培养快速检测方法的研究邵辰指导老师易弋教授专业名称化学工程与技术学科门类工学论文提交日期2015.05分类号密级公开UDC学校代码10594硕士学位论文题目罗非鱼无乳链球菌免培养快速检测方法的研究英文题目AstudyonrapidandfreeculturedetectionoftilapiaStreptococcusagalactiae姓名邵辰专业名称化学工程与技术学科门类工学指导老师易弋论文提交日期2015.05论文答辩日期答辩委员会主席论文评阅人独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下独立完成所取得的成果。除文

2、中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期广西科技大学硕士学位论文摘要摘要罗非鱼是一种世界性的养殖鱼类，原产于非洲，现全球罗非鱼年产量高达390万吨。2014年中国年产罗非鱼150万吨，其中50%用于出口加工，是中国出口加工养殖规模最大的淡水鱼类。近年来，罗非鱼细菌病频繁爆发，严重损害了养殖户的经济利益，其中以链球菌病的危害最为严重。链球菌病爆发速度快，致病死亡率高，是一种很难防治的疾病。罗非鱼患链球菌病后，通

3、常使用抗菌药物进行治疗，但当罗非鱼已出现明显症状，养殖户意识到罗非鱼患病的时候，链球菌的感染已处于中后期，加上该病的爆发速度非常快，使用抗菌药物的治疗效果较差。所以，在感染初期，罗非鱼还未出现病症的时候，能成功诊断出鱼体是否感染无乳链球菌，并做出相应的措施，对于链球菌病的防治极为关键。无乳链球菌是罗非鱼链球菌病的主要致病菌之一，为了准确快速的检测罗非鱼体内的无乳链球菌，本研究针对无乳链球菌的cfb基因片段，依靠分子生物学中的聚合酶链式反应，建立了巢式PCR检测方法。通过细菌纯培养检测实验，人工配置含菌罗非鱼血液检测实验，攻毒与活体检测实验，对该方法进行了初步研究，完成

4、了以下内容：1.以纯培养的无乳链球菌作为模板，采用巢式PCR进行检测，初步摸索检测条件。以无乳链球菌的cfb特异基因为模版设计出2对引物，建立了以巢式PCR为手段的检测方法。实验结果表明，巢式PCR反应条件应设定循环次数设定为25+25次，两轮PCR的退火温度均为55℃。在此条件下能够快速检测出无乳链球菌，灵敏度可以达到8.7×100CFU/mL，远高于传统PCR检测方法的8.7×105CFU/mL。此外，我们对包括无乳链球菌在内的10种罗非鱼常见病原菌进行检测，结果表明除无乳链球菌外，其他病原菌菌不会产生阳性结果，说明该方法有很好的特异性。2.以人工制备的含菌罗非鱼

5、血液作为模版，模拟患病罗非鱼血液，采用巢式PCR方法进行检测，进一步摸索实验条件。在本部分的实验中，我们抽取健康罗非鱼血液，与不同量的无乳链球菌菌液混合，模拟不同感染程度下患病罗非鱼血液。实验结果显示：巢式PCR循环次数设定为35+30次时，检测灵敏度可达到8.7×104CFU/mL。对包括无乳链球菌在内的10种罗非鱼常见病原菌进行检测，只能检测出无乳链球菌，不会出现假阳性现象，有很好的特异性；对以往从柳州各地采集到的14株无乳链球菌进行检测，均能得到正确的阳性结果。重复性试I广西科技大学硕士学位论文摘要验表明在三个周期内共15次实验1080个结果中，检测结果重现数为

6、1066个，检测结果重现率达98.7%。3.选取体重约100g的健康罗非鱼，注射无乳链球菌菌液，进行人工感染实验，同时以注射生理盐水作为对照。人工感染后，记录罗非鱼死亡情况及不同阶段的发病特征；在不同感染阶段抽取罗非鱼血液进行平板计数，检测血液中无乳链球菌的含量，发现血液中无乳链球菌含量与发病阶段的关系；同时抽取罗非鱼血液进行巢式PCR检测，从而确定该方法能在感染的哪个阶段检出血液中的无乳链球菌。实验结果显示：在罗非鱼感染病原菌后，血液中无乳链球菌浓度的数量级为105CFU/mL时，会表现出较明显的症状，而巢式PCR检测方法能够检测到血液中浓度为104CFU/mL的无

7、乳链球菌。4.对广西地区患病罗非鱼进行巢式PCR快速检测，并进行致病菌的分离鉴定。2014年共出诊50余次，共获得46株致病菌，其中无乳链球菌24株，均能通过巢式PCR实现免培养快速检测，而其他种类的致病菌无法在巢式PCR反应中获得阳性结果。对其进行药物敏感性实验，获得了大量数据，对无乳链球菌的防范和治疗提供数据基础。关键词：罗非鱼，链球菌病，巢式PCR，无乳链球菌，免培养检测II广西科技大学硕士学位论文AbstractAbstractThetilapiawascomefromAfricaandbecomeaworldwideculturedaqua