罗非鱼无乳链球菌c5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究

《罗非鱼无乳链球菌c5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、学校代码：10264研究生学号：M100101075上海海洋大学硕士学位论文罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的原核题目：表达及其免疫原性研究ProkaryoticexpressionandimmunogenicityanalysisofC5apeptidase英文题目：ofStreptococcusagalactiaeisolatedfromtilapia专业：水产养殖研究方向：水产健康养殖姓名：李庆勇指导教师：卢迈新研究员二0一三年四月二日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立

2、进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适

3、用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李桂峰中山大学教授主席广东海大集团畜牧兽医研石和荣研究员委员究院有限公司陈昆慈珠江水产研究所研究员委员郑光明珠江水产研究所研究员委员刘志刚珠江水产研究所实习研究员秘书珠江水产研究所答辩地点答辩时间2013.5.25科技楼1楼会议室上海海洋大学硕士论文罗非鱼无乳链球菌C5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究摘要无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，可

4、导致水生动物、哺乳动物及人类等患败血症、肺炎及脑膜炎等疾病。无乳链球菌已经成为多种鱼类的主要致病菌，尤其是暖水性鱼类，给水产养殖业，特别是集约化鱼类养殖造成巨大的经济损失，也是危害我国养殖罗非鱼的主要病害，已经严重阻碍了我国罗非鱼产业链的健康发展。本研究以罗非鱼无乳链球菌为对象，通过生物信息学、分子生物学等技术，克隆了无乳链球菌ZP-N菌株C5a肽酶scpB基因，分析了ScpB蛋白抗原表位的分布，并利用原核表达获得了有活性的重组蛋白，同时对该蛋白的免疫原性进行了研究。主要研究内容及结果如下：1无乳链球菌scpB基因的克隆及原核表达质粒的构建为了解无乳链

5、球菌表面蛋白C5a肽酶scpB基因免疫表位及毒力作用基团的相关信息，本文通过提取罗非鱼无乳链球菌基因组DNA，利用特异性引物PCR扩增出scpB基因的全长开放阅读框(ORF)。结果表明，该基因包括3405bp的ORF，可编码1134个氨基酸，与已报道的人源无乳链球菌ScpB的氨基酸同源性达99.74%。利用生物信息学软件DNAstar、ClustalX2.0和MEGA5.05及在线分析工具ExPASyProtParam、NCBIProtenblast及ConservedDomain等对推导的氨基酸序列进行分析，结果显示罗非鱼无乳链球菌scpB基因编码的

6、氨基酸序列含有3个催化三联体(Catalytictriad)位点，7个假定活性位点(Putativeactivesite)，2个特异位点(Specifichits)，以及4个超家族结构（2个肽酶超家族结构Peptidases-S8-S53superfamily，1个类纤连蛋白超家族结构DUF1034superfamily和1个鞭毛钩蛋白超家族结构FlgD-lgsuperfamily）。ScpB氨基酸序列有多个抗原表位，推测ScpB蛋白应具有较强的免疫原性，可作为候选的蛋白疫苗成分。将该基因片段插入原核表达载体pET32a(+)，转入大肠杆菌BL21(D

7、E3)。挑取阳性克隆，经PCR、酶切及测序鉴定表明成功构建原核表达载体pET32a+/scpB，为获得大量ScpB蛋白开展其免疫防治提供了条件。2无乳链球菌C5a肽酶的原核表达及其免疫原性研究本研究从本实验室分离到的罗非鱼无乳链球菌基因组DNA中扩增出scpB基因高保守片段，构建原核表达质粒pET32a(+)-scpB，并转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导重组蛋白表达，表达的重组蛋白用镍离子金属螯合柱纯化及超滤管I上海海洋大学硕士论文浓缩除盐，采用SDS-PAGE和Westernblot进行鉴定。纯化的融合蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合制成疫

8、苗后免疫罗非鱼以分析其免疫原性。免疫罗非鱼后，每周采血测各组血清中溶菌酶活性、超氧化物歧化酶(