转多基因107杨遗传检测及抗性表达研究

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位（毕业）论文转多基因107杨遗传检测及抗性表达研究学位申请人：王奥漩指导教师：杨敏生教授学科专业：生物安全学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月四日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:签

2、字日期：年/月乂曰学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者毕业后去向电邮话编工作单位：通讯地址：分类号：S722.3+6单位代码：10086密级：公开学号：2012380转多基因107杨遗传检测及抗性表达研究Studyongeneticdetectionandresistancee

3、xpressionofthetransgenicPopulus×euramericana‘Neva’withmulti-gene学位申请人：王奥漩指导教师：杨敏生教授学科专业：生物安全学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年六月四日摘要为了培育抗逆、速生、优质杨树新品种，本试验对通过农杆菌介导法获得的13个转p209-Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨株系进行遗传检测和抗性表达研究。通过PCR检测，筛选转基因107杨株系；通过荧光定量PCR分析，获得外源基因在转录水平上进行表达的转基因株系；ELISA毒蛋白检测，获得目的基因在翻译水平上进行表达

4、的转基因株系；抗虫性试验和耐盐性试验进一步鉴定筛选转基因高抗株系，最终获得3个转多基因高抗株系。主要研究结果如下：1.将13个经抗性筛选的转基因株系组培苗扩繁、驯化后，移栽至大田，获得转基因株系大田苗。分别以质粒p209-Cry1Ac-Cry3A-BADH和未转基因107杨为阳性对照和阴性对照，对13个转基因株系进行PCR检测：NPTⅡ基因的检测结果显示，13个转基因株系和阳性质粒均扩增出约473bp的目的条带；Cry1Ac基因检测结果显示，10个转基因株系和阳性质粒扩增出约546bp的目的条带；Cry3A基因检测结果显示，5个转基因株系和阳性质粒可扩增出大小约667bp的目

5、的条带；BADH基因检测显示，4个转基因株系和阳性质粒可扩增出507bp的目的条带，未转基因107杨无目的片段的扩增。由于时间和栽植苗木的存活问题，最终获得8个转基因株系进行后续试验。2.对PCR初步筛选获得的8个转基因株系和未转基因107杨（CK），提取总RNA后，反转录合成cDNA，进行荧光定量PCR检测。检测获得3个转多基因（10、11、13）株系，1个转双Bt基因株系（1），4个转Cry1Ac基因株系（3、4、6、8）。8个株系的Cry1Ac基因均在转录水平上表达，转录丰度为3.127E+03～2.652E+05；4个株系的Cry3基因转录丰度为2.916E+03～5

6、.699E+04；3个株系的BADH基因转录丰度为1.910E+03～1.010E+04；CK未检测到荧光扩增信号。3.采用美国Agdia公司ELISA试剂盒对8个转基因株系和未转基因107杨（CK）进行Cry1Ac毒蛋白检测，3个转多基因株系（10、11、13），1个转双Bt基因株系（1），4个转Cry1Ac基因株系（3、4、6、8）均呈阳性显色反应，CK无显色现象。表明转基因株系均在翻译水平上有Cry1Ac基因表达，Cry1Ac毒蛋白含量为7.99ng·g-1～26.32ng·g-1；根据Cry1Ac毒蛋白含量多少对3个转多基因株系排序为10＞11＞13号株系，10、11

7、、13号株系间存在一定差异性但未到达显著水平。4个含双Bt基因株系的Cry3A毒蛋白检测结果均呈阳性反应，CK无显色反应。说明Cry3A基因进行了翻译表达，表达量为2108.91ng·g-1～2724.79ng·g-1。3个转多基因株系Cry3A毒蛋白含量排序为10＞11＞13号株系。各株系Cry3A毒蛋白含量显著高于Cry1Ac毒蛋白含量。4.分别用已知美国白蛾高抗株系PB29、柳蓝叶甲高抗株系CC84，未转基因107杨（CK）为阳性对照和阴性对照，对8个转基因株系进行饲虫试验。对比判断转基因株系的抗