羊源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

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1、分类号UDC密级编号专业硕士学位论文羊源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究Isolation,identificationandbiologicalcharacterizationofcitrobactorfreundiifromthediseasedsmalltailHansheep学位申请人：刘会胜指导教师：赵战勤副教授汪洋副教授合作教师：杨荣恩高级兽医师专业领域：兽医学位类别：兽医硕士2015年06月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方

2、外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：摘要摘要2014年河南省某规模化羊场的小尾寒羊大量死亡。病羊主要表现为可视黏膜发绀，然后突然倒地，四肢震颤，发出痛苦低沉鸣叫声，常于发病后8-24h突然死亡，病死率100%。为了确定导致小尾寒羊细菌性感染死亡的病原。对3只不同时间发病死亡的小尾寒羊进行系统剖检，均呈现典型的败血症性病理变化。主要表现为腹腔有少量积液，肺脏、心肌、

3、大肠、小肠和肾出血，肝、脾肿大并严重出血，脑轻度水肿。并从各组织脏器的病料中分离到3株细菌，命名为:LK-1、LK-2和LK-3。常规生化鉴定结果表明3株分离菌与弗氏柠檬酸杆菌的生化特性相符。全自动微生物鉴定仪的鉴定表明3株分离菌均为弗氏柠檬酸杆菌，可能性超过99%。16srRNA基因的比对分析表明与三者同源性最高的均为NCBI数据库已发布的弗氏柠檬酸杆菌的16SrRNA基因序列，其同源性均在99％以上。系统发育树表明LK-1株与日本弗氏柠檬酸杆菌NBRC16624株亲缘关系最近。以上鉴定结果均表明3株分离菌为弗氏柠檬酸杆菌。为了进一步确

4、定弗氏柠檬酸杆菌是否为小尾寒羊死亡的致病细菌。用LK-1株进行回归试验，经人工感染LK-1株的健康小尾寒羊，可复制与自然发病羊相似的临床症状和败血症病理变化，且从感染病羊各组织脏器中再次分离到相同的弗氏柠檬酸杆菌。回归试验证实了弗氏柠檬酸杆菌对健康小尾寒羊具有较强的致病性，表明弗氏柠檬酸杆菌是该小尾寒羊致死性病例的病原菌。取自然发病羊和人工感染羊的各组织脏器进行固定并制作病理切片，病理结果表明自然发病羊和人工感染羊的病理变化相同，肺、脾、心和脑病理变化最严重。均表现为肺泡壁毛细血管充血、出血，肺泡内充满红细胞和纤维素性渗出物。脾脏组织内严

5、重出血，脾小梁结构变小甚至看不到脾小梁，有大量红细胞浸润。心肌纤维断裂、间质增宽、排列紊乱并有红细胞和炎性细胞浸润。脑组织轻度水肿，血管周围有炎性细胞浸润。小鼠毒力试验结果表明：3株细菌的LD7750分别为5.0×10CFU、6.0×10CFU和5.8×107CFU。药敏试验结果表明，3株弗氏柠檬酸杆菌均对庆大霉素等12种药物高度敏感。小鼠免疫保护试验结果表明传统的白油疫苗和新型GEL疫苗均能提供70%的保护率，并且两者可以诱导相同的IgG抗体水平。根据药敏和小鼠免疫保护试验结果指导该养殖场用庆大霉素注射易感染羊群、用生石灰对地面消毒和L

6、K-1株GEL佐剂灭活疫苗免疫所有成年羊和断奶羊羔，取得了良好的治疗和预防效果。本文在国内外首次报道了弗氏柠檬酸杆菌对小尾寒羊具有致病性。并为该病I摘要的致病机理、综合防控和高效疫苗的研制、开发奠定了基础。关键词：羊；弗氏柠檬酸杆菌；分离；药敏试验；回归试验，免疫原性论文类型：研究报告IIABSTRACTABSTRACTManysmalltailHansheeponascalesheepfarminHenanprovincedied.Clinicsignofthediseasedsheepcontainedcyanosiswithvisi

7、blemucousmembranes,ataxia,groananddied8to24hoursafterinitialclinicalsigns.Thefatalityrateis100%.TodeterminethepathogenicbacteriuminfectingthesmalltailHanSheep,threediseasedsmalltailHansheepweresubjectedtonecropsy,whichshowedsepticemiapathologicalchangescontainedslightence

8、phaledema,reddish,clearliquid(400ml)wasfoundwithinthethoraciccavity,diffusehemorrhagesinthelungs