质粒介导的多重耐药弗氏柠檬酸杆菌耐药机制研究

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1、质粒介导的多重耐药弗氏柠檬酸杆菌耐药机制研究MechanismofPlasmid-mediatedMultidrugResistanceinCitrobacterfreundii作者姓名：冯娇专业名称：临床兽医学指导教师：高英杰教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月5日中文摘要质粒介导的多重耐药弗氏柠檬酸杆菌耐药机制研究碳青霉烯类抗生素是一类抗菌谱广、抗菌活性强的β-内酰胺类抗生素，对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和厌氧菌都有抗菌作用，且其活性不受β-内酰胺酶的影响，对AmpC酶（AmpC-typ

2、eenzymes）和超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs）高度稳定。但近几年，对碳青霉烯类抗生素耐药的菌株在全球范围内广泛增多，尤其是革兰氏阴性菌，且呈逐年增多形式。因此，日益严重的细菌耐药性问题引起了全球性的高度关注。碳青霉烯酶是一类能水解碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺酶，包括Ambler分类中的A类、B类和D类。A类和D类酶为丝氨酸酶，B类酶为金属酶。碳青霉烯酶被认为是菌株对碳青霉烯酶类抗生素产生耐药性的最主要原因。本研究的目的主要为探索分离自我国珠江

3、医院的多重耐药弗氏柠檬酸杆菌112298耐药的分子机制。共收集来自该医院的70株耐碳青霉烯菌株，经筛查选定同时表达碳青霉烯酶KPC和NDM的菌株112298进行深入研究。112298分离自感染性休克患者的尿液标本，通过16SrRNA鉴定112298的菌种，碳青霉烯酶基因和ESBLs基因筛查112298携带的基因，改良CarbaNP法检测碳青霉烯酶的类型，通过最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration）测定菌株的抗生素敏感性，通过接合转移实验验证携带碳青霉稀酶基因的质粒是否有可

4、转移性。结果显示，弗氏柠檬酸杆菌112298同时产KPC型和NDM型碳青霉烯酶，blaKPC位于质粒p112298-KPC（注册号：KP987215），blaNDM位于质粒p112298-NDM（注册号：KP987216）。其中质粒p112298-NDM为可接合型质粒，通过接合转移实验得到接合子112298-NDM-EC600，而p112298-KPC不可通过接合转移的方式进行水平转移。质粒p112298-KPC和p112298-NDM都可通过电转化的方式进行水平转移，得到转化子112298-KPC-TOP

5、10和112298-NDM-TOP10。112298携带有耐药基因blaKPC、blaNDM、blaOXA-1group、blaCTX-M-9group和blaSHV，112298-NDM-EC600和112298-NDM-TOP10携带blaNDM和blaSHV，112298-KPC-TOP10携带blaKPC、blaOXA-1group和blaCTX-M-9group。改良CarbaNP试验得出，112298产A类和B类碳青霉烯酶，112298-KPC-TOP10产IA类碳青霉烯酶，112298-NDM

6、-EC600和112298-NDM-TOP10产B类碳青霉烯酶。MIC值提示112298对青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂、头孢菌素类、单酰胺菌素类、碳青霉烯类抗生素的耐药性均可水平转移，而对喹诺酮类、呋喃类抗生素的耐药性则无法通过接合转移或电转化的方式转移。对质粒p112298-NDM和p112298-KPC的全序测定及分析得出，质粒p112298-NDM为53.4kb的IncX3型质粒，而p112298-KPC是大小为117kb的新型质粒。质粒p112298-KPC中携带blaKPC-2的Tn1721-ba

7、sed转座子和其它抗性基因及可移动元件共同组成一个多重耐药（multidrugresistance，MDR）区。p112298-NDM与pNDM-HN380高度相似，其中blaNDM基因位于Tn125可变区，p112298-NDM中Tn125与其原型的不同之处在于上游的ISAba125被IS5替换及下游缺失1拷贝ISAba125.弗氏柠檬酸杆菌112298同时产KPC-2型和NDM-1型碳青霉烯酶，使其对碳青霉烯类抗生素的耐药性增强。值得引起注意的是p112298-KPC除携带blaKPC-2外还有多种耐药

8、基因，包括氨基糖苷类抗性基因、头孢菌素类抗性基因、氯霉素抗性基因、利福平抗性基因、季铵盐类抗性基因、磺胺类抗性基因、喹诺酮抗性基因、氨苄西林抗性基因、铬酸盐抗性基因、磷霉素抗性基因等，且还有多个移动元件，如插入序列、转座子和1类整合子。大量耐药基因的共存势必会加速菌株的进化，使菌株快速获得并保留不同的抗性基因，在不同的抗生素选择压力下，这将加速耐药菌株的扩散和持续，政府卫生部门和医务工作者应加强监控，以防微杜渐。