碳点的细胞行为学研究与神经示踪应用

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1、中文摘要碳点的细胞行为学研究与神经示踪应用周围神经损伤是临床上的常见病、多发病，也是疑难病，其难点是损伤后神经功能恢复欠佳甚至不恢复，这与神经损伤的程度、部位、性质、手术修复的方法与时机、术者手术技巧及病人的整体状况等诸多因素有关。临床上判断神经功能恢复及轴突再生水平通常采用肌力测定、感觉功能检查、肌电图、Tinel征等方法，但这些方法缺乏时效性且判断结果受主观因素影响不够准确也不直观。因此，探索神经损伤修复后能够早期、客观、准确地评价神经再生水平的检测方法，对于判断神经修复效果及功能转归至关重要。神经示踪技术是神经解剖学和神经再生研究中最常用的方法之一，较神经电生理

2、和行为学检查可更直观地评价神经再生水平，并能反映神经功能恢复的程度。传统神经示踪剂包括辣根过氧化物酶、生物素葡聚糖胺、亲神经性细菌毒素、有机荧光染料等都存在各自缺点，如复杂的操作过程、费时的免疫组化染色、荧光信号弱以及易光漂白等。近年来，荧光纳米材料被广泛应用于生物传感器、细胞标记、活体成像和其他生物医学应用中。碳点是一类具有纳米尺寸的新型碳基荧光粒子，包括碳纳米点、聚合物点和石墨烯量子点，三者具有不同的尺寸、表面电荷和量子产率，因此展现出不同生物学效应。但总体上，他们都具有良好的水溶性、稳定的化学性质、抗光漂白、易于化学修饰、激发依赖性多色发光，最重要的是，相比于重

3、金属半导体量子点，碳点具有低毒性和极佳的生物相容性，有较好的临床应用前景。掌握碳点的细胞摄取机制与细胞内分布情况，评价碳点的动物体内毒性，利用碳点独特的光学和生物学性质制备新型荧光纳米神经示踪剂，是本论文的三个研究主题。第一部分是三种荧光碳点的细胞行为学研究，是其细胞水平相关应用的重要基础。我们以神经细胞为研究对象，包括大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（交感神经系统肿瘤细胞）和大鼠雪旺细胞（周围神经系统正常神经细胞），总体的研究思路是从碳点的细胞毒性和细胞摄取速率入手，先确定细胞成像所需最适浓度和最佳孵育时间；然后利用不同的内吞抑制剂研究碳点的具体细胞摄取途径，通过荧I光共定

4、位标记技术观察碳点的细胞内运输及分布情况；最后分析碳点的细胞外排作用。实验结果表明：（1）较小尺寸（1-5nm）的碳纳米点具有极低细胞毒性，其细胞摄取速率极高，5min内即可进入细胞且呈剂量、时间和部分能量依赖性，涉及被动扩散作用和胞膜窖、网格蛋白介导的内吞作用；内化的碳纳米点可通过核孔复合体扩散进入细胞核，但大部分是经内涵体和胞膜窖小体转运至溶酶体和高尔基体，并主动运输到细胞膜周围通过胞吐作用排出细胞。（2）较大尺寸（约60nm）的聚合物点的细胞毒性亦较低，但细胞摄取速率、途径及细胞内分布与尺寸较小的碳纳米点均不相同；15min后开始进入细胞，细胞摄取呈完全能量依赖

5、性，无被动扩散作用，具体机制与胞膜窖介导内吞作用有关；细胞内主要聚集在溶酶体中，少部分分布于线粒体，但不能进入细胞核；其荧光性质较碳纳米点和商品化荧光染料均更稳定。（3）石墨烯量子点同样具有低毒性、时间依赖性细胞摄取、溶酶体集中分布的性质，但是我们的研究重点是利用其更长的激发和发射波长进行活体成像应用，发现石墨烯量子点具有较强荧光信号和较高的信噪比。第二部分是碳点动物体内毒性的系统检测，是其活体成像应用的重要前提。与具有重金属毒性的传统半导体量子点相比，碳点类材料最吸引人的优点是其低毒性和良好的生物相容性，具有临床应用前景。但是有关碳点低毒性的研究通常指低细胞毒性，关

6、于其动物体内毒性研究报道较少。我们以Wistar大鼠为模型，选择尺寸最小（1-5nm）、量子产率最高（约80%）、细胞毒性极低的碳纳米点为研究对象，检测其目前报道最高剂量（100mg/kg）时体内毒性，包括大鼠体重变化、血清生化学检测、全血细胞计数以及主要脏器组织学检查，发现碳纳米点对大鼠血液系统及主要脏器均无明显毒性，为进一步神经示踪应用提供生物安全性保障。第三部分是基于碳点的新型荧光纳米神经示踪剂的创制，是在掌握了高效发光碳纳米点的物理化学性质、细胞行为学和生物安全性的基础上进行的。将其作为荧光标记物，利用无毒性、亲神经性的霍乱毒素B亚基作为配体解决神经特异性；通

7、过偶联反应合成霍乱毒素B-碳纳米点复合物，将其运用于周围神经示踪研究中，发现它可被神经元轴突末梢摄取并逆行运输至神经元胞体，具有较高的荧光强度、良好的光稳定性、较长的生物活性以及低毒性。最重要的是这种新II型神经示踪剂制作成本低且操作过程简单、直接、省时、易于掌握。总之，从三种新型荧光碳点的细胞行为学研究中探讨纳米材料的物理化学性质与生物学性质之间的关联，到选择最适碳点进行生物安全性检测，再到开展新型荧光纳米神经示踪剂的创制与应用。本论文遵循由浅入深原则进行医学与化学的跨学科研究，不仅详细阐述碳点的细胞摄取机制与细胞内分布情况，为其在细胞水平的相关应