资源描述：
《神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的活体示踪研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的活体示踪研究论文张立峰，茅祖斌，蒋赞利【摘要】目的：探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性及神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能恢复的影响。方法：66只SD大鼠随机分为假损伤组（A组）、SCI对照组（B组）和细胞移植治疗组（C组）3组，应用已包被多聚左旋赖氨酸(PLL)的SPIO标记NSCs,对标记细胞进行普鲁士蓝染色，分别在细胞移植后第1、2、3、4、5周对各组动物进行BBB评分，细胞移植后1、3、5周行MRI检查。结果：(1)普鲁士蓝染色证实该方法标记NSC
2、s的有效率为100%。（2）细胞移植后1～5周,B、C组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05)。（3）1.5TMRI检查见移植处在T2R技术活体追踪干细胞的可行性以及NSCs移植对SCI大鼠后肢功能恢复的影响。1材料与方法1.1胎鼠来源NSCs的制备、培养与鉴定［3］取胚龄14dSD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞,.freell－1种瓶,用DMEM/F12(1∶1)无血清培养基［内含bFGF20ng·ml－1、EGF20ng·ml－1、B2720ng·
3、ml－1］培养。每6～7d换液、传代1次。对第2代细胞作免疫组化鉴定：取无血清培养基贴壁分化培养24h的盖玻片1张,4%多聚甲醛固定30min。0.25%Triton-100破膜12min,然后用5%脱脂奶粉封闭特异性抗原,室温孵育30min,吸干残液滴加1∶500小鼠抗大鼠nestinIgG1(一抗),4℃孵育过夜。第2天滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1二抗,室温孵育1h,然后50%缓冲甘油封气,荧光显微镜下观察并摄像。1.2NSCs的标记和染色细胞传至第3代,取适量已包被多聚左旋赖氨酸(poly-L-lys
4、ine,PLL)的SPIO加入10mlDMEM/F12培养基中,37℃振荡60min,使SPIO终浓度为25μg·ml－1,将消化的细胞沉淀加入含SPIO的培养基中孵育12h完成标记。NSCs标记后普鲁士蓝染色:标记后的NSCs换成含10％血清的DMEM/F12培养液，置6孔板中培养7d，去掉培养液，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定30min,PBS洗涤3遍,含2％亚铁氰化钾的6％盐酸溶液常温孵育30min,显微镜下观察。1.3实验动物分组与SCI模型的制作66只成年雄性SD大鼠,体重250～300g,随机分为假
5、损伤组(A组，6只)、SCI对照组(B组，30只)及细胞移植治疗组(C组，30只)3组。B、C两组参照改良的Allen重物打击法［4］制作大鼠脊髓背侧损伤模型：实验前大鼠禁食8h，用戊巴比妥钠(30g·L－1)按40mg·kg－1腹腔注射麻醉,背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上,常规消毒,腰背部正中切口,逐层分开显露T8～T10椎板,行T9全椎板切除,显露硬脊膜,钳夹固定T8及T10棘突,用10.0g的不锈钢棒(直径为2.5mm)沿带有刻度的玻璃导管从25mm高处垂直下落,打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为
6、3mm的撞杆上,后者将打击力传递给脊髓,造成大鼠脊髓不完全损伤,致伤后迅速移开打击物,逐层缝合。模型成功的判断标准:打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩样扑动,麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。A组仅行T9全椎板切除术作对照。术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水2ml,以补充血容量。予青霉素钠盐5万U背外侧肌群肌肉注射预防感染,每天1次,持续3d。注意保温,分笼饲养,自由取食,每天8：00及20：00行膀胱按摩协助排尿,直至建立反射性排尿。1.4细胞移植将第3代悬浮培养的NSCs悬液用台式离心机离
7、心5min(1000r·min－1),将细胞团以少量培养液吹匀,细胞计数为105μl－1。C组动物SCI后9d于损伤节段下0.5cm处用5μl微量注射器以与脊髓水平面呈30°角刺入脊髓组织中,注入2μlNSCs悬液,逐层缝合切口。1.5运动功能评分BBB评分［5］为总分21分的运动功能评分,考察大鼠后肢的运动、躯干的位置和稳定性、步态、协调性、爪的置放、足趾间隙及尾的位置,表示SCI后大鼠后肢运动功能恢复的过程。BBB评分简单直观,易于掌握,与脊髓功能恢复有极好的一致性。分别在动物移植前第7天和移植后1、2、3、
8、4、5周进行盲法BBB评分,由两名熟悉BBB评分标准的非实验人员观察。将动物置于直径1m的平面光滑场地自由活动5min,记录动物后肢运动情况。1.6MR检查于术后第1、3、5周分别行MR检查，扫描序列为T2RI将SPIO标记的NSCs移植到C组SCI下位1周后行1.5TMR检查,见移植处在T2RI可以提供25～50μm的分辨率,接近单一细胞的水平,使其理论上可以用来对移植
