常用神经示踪剂及其示踪特点

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1、常用神经示踪剂及其示踪特点作者：朱贺李丽赵磊马克涛司军强【摘要】丰富的神经示踪技术极大的促进了神经解剖学的发展，为神经生物学的各种研究提供了良好基础，在此，我们概述了常用神经示踪剂及其示踪特点，重点介绍了各种荧光染料和植物凝集素IB4的示踪特点。【关键词】神经示踪剂;辣根过氧化物酶;荧光染料;植物凝集素IB4;病毒自20世纪70年代初Kristenson首次将辣根过氧化物酶(HRP)应用于追踪神经纤维联系以来，该方面的研究取得了前所未有的迅猛发展。此后，许多用途广泛、敏感性强并能选择性地进行顺行、逆行标

2、记或同时具有顺、逆行标记的追踪物质被应用到神经纤维联系的研究，对神经解剖学的发展起到了积极的推动作用。现就常用的神经示踪剂及其示踪特点综述如下：　　1辣根过氧化物酶　　1.1辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase，HRP)15HRP是一种含血红素基的植物糖蛋白。HRP法是20世纪70年代发展并被广泛应用的一种神经追踪方法，但由于HRP显影需要许多复杂的免疫组织化学技术，而且HRP参与细胞代谢，不能在细胞内长期存留，易扩散到邻近组织造成神经元的误染，其反应产物较不稳定，易丢失，另外还存

3、在“再摄取”现象[1]，使得HRP在神经逆行示踪方面的应用大大减少。　　1.2霍乱毒素亚单位B结合的辣根过氧化物酶(CBHRP)R.N.Ranson等[2]对传统的辣根过氧化物酶的染色方法进行了改进，采用结合了霍乱毒素亚单位B的辣根过氧化物酶(CBHRP)作为示踪剂，清晰显示了神经元的胞体和轴突结构。近来也有采用四甲基联苯胺(TMB)为底物替代传统的二氨基联苯胺(DAB)来示踪豚鼠的面神经[3]的报道。TMB与DAB相比有不致癌和HRP反应灵敏度高，操作简便，步骤少，用时短及成本低等诸多优点。　　H

4、RP法标记的神经元经组织化学法处理后,细胞失去了活性,无法进行膜片箝等神经电生理的研究,限制了HRP法在这一领域内的应用。　　2荧光染料15　　从上世纪50年代开始，荧光染料示踪技术发展起来。它贮存稳定，特别是组合采用不同的荧光染料分别标记神经元胞核和胞浆，可实现荧光双标或多重标记，这是荧光素示踪的一个最大优点。这种示踪剂染色后只需使用荧光显微镜，便可观察到已被标记的神经纤维或胞体。下面介绍几种常用的荧光素。　　2.1固蓝(Fastblue，FB)FB系水溶性染料，其颗粒较细密，易于被神经轴索摄取，所以

5、标记神经纤维或胞体多于其他染料，易于从标记细胞内扩散到周围组织，照射时褪色较快，即使保存在低温、避光条件下，仍不能长期保存。对需要标记后较长时间的观察，或需分离培养神经元细胞进行实验研究则不太理想。　　2.2荧光金(Fluorogold，FG)FG系脂溶性染料，能标记细胞质，它在紫外线(323nm)激发下发金黄色光(408nm)，属慢速轴浆运输类，细胞核不着色，能很好显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，不易扩散，与周围组织分界清晰，褪色比较慢，可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等

6、方法结合。其在细胞质内的存在不超过3周[4]。　　有学者将其用于视神经的研究,标记了视神经纤维的分布路径和走向[5]。TakayukiNakajima等[6]采用荧光金结合SP、CGRP免疫荧光标记反应，发现大鼠L6DRG和S115DRG内均存在大小不等的SP/CGRP双标记神经元及中小型大小的FG/SP、FG/CGRP双标记阳性细胞和FG/SP/CGRP三标记阳性细胞，这些标记阳性细胞可能与包皮系带损伤后阴茎自发性疼痛的产生和传递有关。　　2.3羰化青(1,1′Dioctadecyl3,3,3

7、′,3′tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)DiI是一种紫红色晶体，具有高度的亲脂性,在水中的溶解度很低，通常用乙醇溶解。它荧光强而稳定,无毒性，不影响被标记细胞的存活、生长，在标记细胞内消失慢、单纯沿脂质膜扩散，有良好的轴突特异性，且对过路纤维影响小。在549nm激发光下可以产生发射波长为565nm红色荧光[7]。　　1986年Honig[8]等首次报道DiI可作为荧光示踪剂用于培养的神经细胞和骨骼肌细胞。DiI对试管内动物胚胎的感觉和运动神经元没有

8、显著的毒性作用，因而适用于活的组织、细胞的示踪、标记。但也有研究报道显示DiI易于淬灭及易向神经元胞体外扩散的问题[9]。总的来说,DiI具有在细胞内稳定表达、标记细胞形态良好、对活体细胞无毒性、在标记细胞内消失慢[10]、使用简便、染色速度快的特点。尤其是不影响被标记细胞的电生理和生化特性使其越来越多的被用于神经科学领域的研究[11]。　　2.4荧光染料双标染色法双标技术是通过不同示踪剂对细胞核、细胞浆亲和力不同，用两种示踪剂对不同的神经