常用神经示踪剂及其示踪特点论文

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1、常用神经示踪剂及其示踪特点论文朱贺李丽赵磊马克涛司军强【摘要】丰富的神经示踪技术极大的促进了神经解剖学的发展，为神经生物学的各种研究提供了良好基础，在此，我们概述了常用神经示踪剂及其示踪特点，重点介绍了各种荧光染料和植物凝集素IB4的示踪特点。【关键词】神经示踪剂;辣根过氧化物酶;荧光染料;植物凝集素IB4;病毒自20世纪70年代初Kristenson首次将辣根过氧化物酶(HRP)应用于追踪神经纤维联系以来，该方面的研究取得了前所未有的迅猛发展。此后，许多用途广泛、敏感性强并能选择性地进行顺行、逆行标记或同时具有顺、逆行标记的追踪物质被

2、应用到神经纤维联系的研究，对神经解剖学的发展起到了积极的推动作用。现就常用的神经示踪剂及其示踪特点综述如下：1辣根过氧化物酶1.1辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase.freel)激发下发金黄色光(408nm)，属慢速轴浆运输类，细胞核不着色，能很好显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，不易扩散，与周围组织分界清晰，褪色比较慢，可以经受许多组织学染色处理，因而可以和HRP、免疫组织化学等方法结合。其在细胞质内的存在不超过3周4。有学者将其用于视神经的研究,标记了视神经纤维的分布路径和走向5。TakayukiNakaj

3、ima等6采用荧光金结合SP、CGRP免疫荧光标记反应，发现大鼠L6DRG和S1DRG内均存在大小不等的SP/CGRP双标记神经元及中小型大小的FG/SP、FG/CGRP双标记阳性细胞和FG/SP/CGRP三标记阳性细胞，这些标记阳性细胞可能与包皮系带损伤后阴茎自发性疼痛的产生和传递有关。2.3羰化青(1,1′Dioctadecyl3,3,3′,3′tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)DiI是一种紫红色晶体，具有高度的亲脂性,在水中的溶解度很低，通常用乙醇溶解。它荧光强而稳定,

4、无毒性，不影响被标记细胞的存活、生长，在标记细胞内消失慢、单纯沿脂质膜扩散，有良好的轴突特异性，且对过路纤维影响小。在549nm激发光下可以产生发射波长为565nm红色荧光7。1986年Honig8等首次报道DiI可作为荧光示踪剂用于培养的神经细胞和骨骼肌细胞。DiI对试管内动物胚胎的感觉和运动神经元没有显著的毒性作用，因而适用于活的组织、细胞的示踪、标记。但也有研究报道显示DiI易于淬灭及易向神经元胞体外扩散的问题9。总的来说,DiI具有在细胞内稳定表达、标记细胞形态良好、对活体细胞无毒性、在标记细胞内消失慢10、使用简便、染色速度快

5、的特点。尤其是不影响被标记细胞的电生理和生化特性使其越来越多的被用于神经科学领域的研究11。2.4荧光染料双标染色法双标技术是通过不同示踪剂对细胞核、细胞浆亲和力不同，用两种示踪剂对不同的神经纤维或靶器官进行标识。2.4.1固蓝(FastBlue)和核黄(NclearYelloidinoYelloidinoYello，经神经轴浆流的逆行转运可达细胞核，细胞核呈绿色、黄绿色或黄白色。激发后荧光很强时，细胞浆有时映出部分黄绿色或黄白色。C.T.Byers等13比较了固蓝(FastBlue)和双脒基黄(DiamidinoYelloidinoY

6、ello，经神经轴浆流的逆行转运可达细胞浆，激发后细胞浆呈亮蓝色。Yang等14使用双脒基黄和台盼蓝荧光双标研究切断腓总神经后行腓总神经断端和胫总神经吻合的脊髓背根神经节细胞发现,在相应L4L6背根神经节及相应脊髓腰膨大中分别存在双脒基黄和台盼蓝双标的细胞，说明两神经之间有交叉支配的存在，表明神经端侧缝合后的再生方式是侧枝芽生。1991年Fritzsch和Sonntag15比较研究了荧光素和生物素葡糖聚胺的标记效力，随后Harsh16等在1991年又比较了FG素和DiI两者之间的标记效能。1993年，Brushart等人又分别比较研究

7、了荧光素和HRP之间的标记效能。这几种示踪剂的组合的弊端是在同一显微镜下不能被同时观察到。更重要的是，生物素葡糖聚胺和DiI通常情况下不被未损伤神经摄取的特性决定使用两者作为标记物时必须先切断或损伤被标记神经。常用的几种荧光染料中，TB和FB能够标记细胞浆，NY和DY能够特异的结合被标记细胞的细胞核。由于荧光素分子量小，用于逆行追踪的共同问题是易于扩散，比HRP法更难于确定有效注射部位。与HRP法相似，荧光素示踪法也存在过路纤维摄入问题。褪色是荧光素的一大缺点，在激发光照射下较快褪色，因此允许观察的时间短。即使在低温、避光条件下，切片保

8、存时间仍有限，不能长期保存。3生物素葡糖聚胺(Biotindextranamine,BDA)BDA应用于轴浆运输的各种示踪剂，常用来研究神经元的分支投射，但很少有直接用于观察周围神经局部轴突的研究。BDA