沙门菌密度感应系统对六型分泌系统调控的相关研究

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1、分类号UDC密级编号专业硕士学位论文沙门菌密度感应系统对六型分泌系统调控的相关研究StudyonregulationofTypeⅥSecretionSystembytheQuorumSensingSystem学位申请人：杨登辉指导教师：程相朝教授合作教师：于圣青研究员专业领域：兽医学位类别：兽医硕士2015年04月独创性声明本人声明，所呈交的论文是我个人在导师指导下完成的研究工作及取得的研究成果。据我所知，文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河南科技大学或其它教育机构的其他学位或证书而使用

2、过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：日期：摘要摘要沙门菌是一种重要的人畜共患病原菌，在自然界分布广泛。绝大多数沙门菌对人和动物都有致病性，能引起人和动物多种不同临床表现的沙门菌病。沙门菌分为肠道沙门菌和邦戈沙门菌两个种。沙门菌血清型众多，大约拥有2500多种血清型，其中肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌在人类食源性沙门菌病中尤为重要。六型分泌系统（Type6secretionsystem,T6SS）是近年来发现的革兰阴性菌中一种新的蛋白转运系统，它可将蛋白质运送到胞外。T6SS广泛存在于

3、细菌中，其结构组成包括IcmF家族、ATP酶-ClpV、Fha调控蛋白以及分泌相关的VgrG和Hcp蛋白。目前发现T6SS在细菌对外界环境的适应性、对宿主细胞的致病力、生物被膜形成等方面发挥作用。与其他分泌系统一样，T6SS的转录和表达水平也受到严格调控的。有研究证实，在霍乱弧菌中密度感应（Quorumsensing,QS）系统luxS基因能显著影响T6SS主要元件的转录水平。因此，本课题通过构建沙门菌luxS基因缺失株，研究沙门菌中QS对T6SS的影响。1.沙门菌毒力因子多重PCR检测方法的建立及应用通过建立沙门菌不同毒力岛基因的多重PCR

4、方法，对沙门菌毒力基因进行快速、灵敏的检测。根据GenBank序列设计合成16对引物，优化反应条件，建立四组多重PCR方法。利用建立的多重PCR方法对124株沙门菌进行毒力基因检测，结果显示除了sopE基因分布率为15%外，其它15个毒力基因分布率可达90%以上。选取代表性菌株，测定其对小鼠的致病力，结果显示沙门菌均可导致小鼠发病死亡。药敏试验结果显示沙门菌对红霉素、阿奇霉素、克林霉素、新霉素、大观霉素、四环素、利福平等抗生素的耐药率可达90%以上，且存在多重耐药性。2.沙门菌luxS基因缺失株的构建及生物学特性研究利用Red同源重组系统构建

5、沙门菌luxS基因缺失株，并对其生长速度、运动性、生物被膜形成、致病力以及对鼠巨噬细胞RAW264.7黏附入侵等生物学特性进行研究。结果显示，LuxS对沙门菌的生长速度、生物被膜形成能力、致病力及细胞黏附侵袭能力均无明显影响。但luxS缺失株的运动性显著高于野生株。3.密度感应系统LuxS蛋白对T6SS影响的分析克隆表达并纯化T6SS核心组分Hcp1、Hcp2和ClpV蛋白，制备相应的免疫血清。应用荧光定量PCR以及免疫印迹技术对luxS基因缺失株中hcp1、hcp2I摘要和clpV的基因转录水平和蛋白表达水平进行检测。结果显示，无论在对数生

6、长期和平台期，luxS基因缺失株与野生株中T6SS核心组分的转录水平和表达水平均无明显差异。本研究表明QS系统LuxS蛋白并不影响或直接调控沙门菌T6SS核心组分的转录及表达。沙门菌中T6SS系统的调控有待进一步研究。关键词：沙门菌；六型分泌系统；密度感应系统；luxS基因缺失株；调控论文类型：基础研究选题来源：农业部：公益性行业（农业）科研专项；名称：动物源性沙门菌病防控技术研究与示范（编号：201403054）IIABSTRACTABSTRACTSalmonellaisawidelydistributedimportantzoonotic

7、pathogen.MostofSalmonellaarepathogentictohumansandanimals,whichcancauseavarietyofsalmonellosis.Salmonellaisdividedintotwospecies,namelytheSalmonellaentericaandSalmonellabongori.Salmonellaentericaincluding2500serotypesisarepresentativepathogenthatcancausesalmonellosisinhuman

8、andanimalsworldwidely.Anewsecretionsystem,termedtypeⅥsecretionsystem(T6SS),isdisco