百里香酚对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用及机制

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1、ｌｉｉｉｉｌ顏＿，ＩＩＩｉ＾ｒ：＿Ｉｉｎ＿＿＿中文摘要百里香酚对沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的抑制作用及机制沙门氏菌是引起人类和动物食物中毒的首要食源性病原菌之一，也是在全球公共卫生学上有重要意义的人兽共患病原菌，该病原菌在自然界有广泛的宿主谱。沙门氏菌感染动物后常导致严重的疾病，给畜禽养殖业带来严重的经济损失。其中鸡白痢沙门氏菌是危害养鸡业发展的重要传染病之一。目前临床上沙门氏菌感染较难控制，治疗效果往往不理想，给畜禽养殖业造成了巨大的经济损失，甚至严重威胁公共健康和食品安

2、全。目前针对沙门氏菌感染，普遍采用抗生素进行治疗，但由于抗生素的长期使用和滥用不可避免的诱导细菌耐药性产生，耐药谱逐渐加宽。这一现象对于临床上沙门氏菌感染的治疗更是雪上加霜。因此临床上迫切需要寻求新的抗感染策略及药物来预防和治疗沙门氏菌感染。近年来研究发现病原菌的致病力与其分泌的各种毒力蛋白或效应蛋白密切相关，但上述蛋白分子不是细菌生命所必需成分。因此，以细菌特异性用于感染宿主细胞的蛋白或者蛋白复合物为靶标的药物，不仅可发挥抗细菌感染作用，且对细菌产生的选择性压力小，不易诱导细菌耐药性。Ⅲ型分泌

3、系统（T3SS）广泛分布于革兰氏阴性细菌中，其主要功能是分泌和转运病原菌毒力因子。对于沙门氏菌，其致病力便是通过两套T3SS系统分泌效应蛋白来发挥致病作用，分别介导细菌侵入和胞内增殖，在其致病过程中起着决定性作用。此外，这些效应蛋白在细菌逃避免疫系统攻击过程中也发挥着不可或缺的作用。研究表明，缺失沙门氏菌Ⅲ型分泌系统某些基因或者效应蛋白，沙门氏菌感染宿主的能力显著或者完全丧失。中药自应用至今已有数千年的历史，其中的有效化学成分在抗细菌感染方面的作用已清楚确立。这些天然化合物具备分布广泛,结构多样

4、,生物学活性丰富等多方面的优势，是新药开发和先导化合物发现的宝贵资源。而且由于这些有效化合物往往不具有传统的杀菌活性，其诱导耐抗药性的可能性也很低。I本研究通过构建沙门氏菌Ⅲ型分泌系统报告系统，建立了Ⅲ型分泌系统抑制剂筛选平台。发现百里香酚和香芹酚等多种天然化合物可抑制其功能，且不影响细菌生长。体内外药物活性实验，发现百里香酚能够显著降低细菌的侵入宿主细胞的能力，并对沙门氏菌感染小鼠引起的死亡具有显著的保护作用。通过生化指标监测，发现百里香酚对由沙门氏菌感染引起的小鼠体重下降有显著的恢复作用。病

5、理组织学分析，百里香酚能够缓解沙门氏菌引起的小鼠盲肠损伤。并且给予百里香酚后盲肠组织的主要炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ含量显著下降。为了阐明百里香酚抑制沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的作用机制，本研究通过质谱分析、体外生物化学实验、分子生物学的方法，验证沙门氏菌经过百里香酚处理后，其Ⅲ型分泌系统组分的多个关键蛋白产量显著下降。圆二色谱和点击化学方法分析，药物作用于Ⅲ型分泌系统主要效应蛋白SipA的两个不同结构区域，并且在蛋白折叠的过程中，改变了效应蛋白SipA的二级构象。体外蛋白孵

6、育实验，发现经过药物处理后的效应蛋白SipA，在ATP供能的条件被蛋白酶Lon所降解。综上所述，百里香酚在SipA蛋白表达的过程中与其发生相互作用，其二级构象发生变化，进而被蛋白酶Lon降解。同时百里香酚还能够影响Ⅲ型分泌系统调控蛋白HilA，引起Ⅲ型分泌系统多个效应蛋白发生下调。通过人工感染动物模型进行体内药物活性评价，发现百里香酚对沙门氏菌感染引起的小鼠死亡具有保护作用。本研究从分子遗传、生化、生物物理和点击化学等多种实验方法验证了百里香酚抗沙门氏菌Ⅲ型分泌系统的作用靶点及机制，为抗沙门氏菌

7、Ⅲ型分泌系统药物的研发提供依据，为我国畜禽沙门氏菌感染创新药物研发打下良好基础。关键词：沙门氏菌；Ⅲ型分泌系统；百里香酚；效应蛋白IIAbstractInhibitoryeffectandmechanismofthymolagainstSalmonellatypeⅢsecretionsystemPathogenicSalmonellaspeciesarguablyarethemostimportantfood-bornepathogeninhumansandanimalscausedbyfood

8、poisoning,theyarealsoimportantzoonoticpathogens.Salmonellaentericaistheleadingcauseofcommunity-acquiredbloodstreaminfectionsinmanylowandmiddleincomecountries.Thesepathogenshaveabroadrangeofnaturalhostsincludingmammals,reptiles,birdsandinsects.Salmone