密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响

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1、学校代码：10264研究生学号：M120250561上海海洋大学硕士学位论文密度感应系统对弗氏志贺菌题目：生长竞争能力的影响Theeffectofquorumsensingsystemfor英文题目：growthcompetitivenessonShigellaflexneri专业：食品工程研究方向：细胞微生物学姓名：徐苹导师：王恒樑研究员指导老师：朱力副研究员二O一五年四月七日I上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个

2、人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日II答辩委员会成员

3、名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期III上海海洋大学硕士学位论文密度感应系统对弗氏志贺菌生长竞争能力的影响摘要志贺氏菌是细菌性痢疾的主要病原体，一般感染10-100个志贺式菌就能使人发病，全世界每年的感染人数可达到1.6亿，其中发展中国家的死亡病例高达90%以上。志贺氏菌传播的主要途径是粪口，其可以入侵炎症上皮细胞，导致脓肿和溃疡等强烈的炎症反应。近年来，微生物群体间的相互作用越来越引起人们的关注，细菌所表现出的细胞相互作用，如抗生素的产生、菌体自身的发育及孢子的形成等，都需要高密度细胞共同协作完成。而密度感应系统是细菌间重要的交流系统，可通过细菌密度来调控这些协作行为。

4、据研究显示，在基因组水平上，大肠杆菌和志贺氏菌存在同源性和相似性，但两者在表型及致病性方面表现出较大的差异。通过对比两种菌的基因序列发现：在两者的基因序列中，都含有密度感应系统操纵子基因，但两者存在一定差异。与大肠杆菌体内的密度感应系统相比，志贺氏菌体内缺少了密度感应系统的某些基因，如lsrK，lsrB，lsrF。本研究利用传统的酶切连接法构建了密度感应系统缺失基因回复株301/pPro-lsrBFK，利用GoldenGate克隆法构建了完整密度感应系统回复株301/pET28a-lsrKG。测定了弗氏2a志贺菌301野生株，301/pPro-lsrBFK，301/pET28a

5、-lsrKG的生长曲线，比较它们在生长方面的差异；将两种不同细菌混合培养，通过菌落计数，分析判断缺失基因回复后对细菌生长优势的影响；制备野生株301、301/pPro-lsrBFK与301/pET28a-lsrKG的蛋白样品，进行双向凝胶电泳，比较野生株301、301/pPro-lsrBFK与301/pET28a-lsrKG的蛋白图谱并寻找差异蛋白点，经质谱鉴定得到差异蛋白点的信息，分析差异蛋白的可能作用。有关实验的详细结果，综合如下：1．利用酶切连接法和GoldenGate克隆法成功构建了密度感应系统缺失基因回复株301/pPro-lsrBFK和完整密度感应系统回复株301/

6、pET28a-lsrKG。2．利用哈氏弧菌BB170对信号分子AI-2生物发光的特性，检测弗氏2aIV上海海洋大学硕士学位论文志贺菌301可以向胞外释放并分泌有活性的信号分子AI-2，并使哈氏弧菌BB170产生荧光。3．301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG与野生株301相比，在生长曲线上没有较大差别，但301/pPro-lsrBFK、301/pET28a-lsrKG菌株在稳定期达到的细菌密度更大。4．对301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG，野生株301，MG1655进行混合培养，通过菌落计数计算其生长比例，其结果表明：缺失

7、基因回复株301/pPro-lsrBFK与野生株301相比，不具有生长优势；而完整基因簇回复株301/pET28a-lsrKG与野生株301相比，具有较明显的生长优势。5．利用双向凝胶电泳和质谱技术，对比301/pPro-lsrBFK，301/pET28a-lsrKG和野生株301的全菌蛋白双向凝胶电泳图谱，运用比较蛋白质组学分析差异蛋白点。结果表明：缺失基因回复株301/pPro-lsrBFK相对于野生株301来说，蛋白差异点不明显；完整基因回复株301/pET28a-lsrKG相对于野生