luxsal-2型密度感应系统对禽致病性大肠杆菌的调控研究

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1、AnhuiAgricpLturalUniversityMasterDissertationTheRegulationofQuorumSensingofLuxS／AI一2inAvianCandidate：PathogenicEscherichiacoliBaiHaoSupervisor：￡墅Qi堡墨曼Q￡Qi!鱼：圣Q坠g里!旦l堡墨曼Q￡至ru§h星坠g：gi垒g△墨墨Q堡i丛曼￡煦i查墨Q￡H鱼塾丕i坌坠：g垫AcademicDegreeappliedfor：坠焦亟墨!曼!Qf』鳖g￡i曼丛L地!鱼Major：旦垒墨i堡篁区曼!i塾ii!XS璺i星丛曼曼Direction：!

2、§避i堡丛里坌堂Q!QgY鱼匹亟旦iQ!Qg地垦!里!盟l选iQ垒College：￡Q!!鳄星Q￡△避i望堕!墨堡i星堡曼塑亟墅堡丛Q!Q旺June2013独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究牛签名：鱼熟时间：沙I弓年厂月j日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文

3、的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：鱼熊时间：加f多年f月j日第一导师签名时问：沙B年6月j日国家自然科学基金资助项目：《信号分子触．2对禽致病性大肠杆菌的调控作用研究》项目编号31001078《禽源致病性大肠杆菌HPI毒力岛缺失株构建及其致病性研究》项目编号30871851摘要禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(AvianPathogenicEscherichiac

4、oli，APEC)弓I起的严重影响养禽业的传染病之一。LuxS／AI．2型密度感应系统广泛存在于革兰氏阴性和阳性菌中，可产生用于细菌种间交流的通用自诱导信号分子AI．2(Autoinducer-2，AI．2)，在细菌的许多生理功能中扮演着重要的角色。目前禽致病性大肠杆菌复杂的血清型和广谱的耐药性，给禽大肠杆菌病的防控提出了新的挑战，该菌LuxS／AI一2型密度感应系统的研究国内外尚未见报道。本研究旨在通过对APEC的LuxS／AI一2型密度感应系统探究，为防控APEC感染，从细菌群体角度提供了新的思路，为进一步研究密度感应系统对APEC的调控功能和机理提供参考。1．禽致病性大肠

5、杆菌甜．2的检测及其因素分析为探讨APEC中是否存在LuxS／AI．2型密度感应系统。利用哈维弧菌BBl70(vibrioharveyiBBl70)对APEC是否产生信号分子AI．2进行检测，结果表明APEC能产生自诱导信号分子AI一2。为探讨禽致病性大肠杆菌在不同生长时期和不同培养条件下，信号分子AI．2活性与luxS和pfs的转录水平之间的关系。本研究利用哈维弧菌BBl70检测不同生长时期和不同培养条件下APEC的AI．2活性。同时利用Real—timePCR检测APEC不同生长时期和不同培养条件下luxS和pfs的转录水平。结果表明，APEC在不同生长时期的AI一2活性与

6、luxS的转录水平保持一致，而与pfs的转录水平则并不一致。对影响AI．2活性的因素研究表明，葡萄糖，麦芽糖和NaCl可增强AI．2活性和luxS转录水平，而蔗糖则下调AI．2活性和luxS转录水平。2．禽致病性大肠杆菌m．2的合成及其对生物被膜的影响通过对APEC的luxS和pfs基因的克隆、表达和纯化，成功获得了可用于AI一2体外合成的可溶性重组蛋白LuxS和Pfs。利用纯化后的LuxS、Pfs与S．腺苷同型半胱氨酸(S．adenosylhomocysteine，SAH)同时体外催化作用后，成功获得浓度为3001maol／L的信号分子AI一2。为研究AI一2对APEC生物被

7、膜形成能力的影响。本研究采用改良结晶紫半定量法和荧光染色法检测AI一2对APEC生物被膜形成能力的影响。结果表明，AI一2在浓度为0．185mmol／L时，生物被膜形成能力显著增强。3．禽致病性大肠杆菌luxS缺失株的构建及致病性分析LuxS／AI．2型密度感应系统对细菌具有重要的调控作用。为进一步研究该系统对APEC的调控作用，本研究构建了APEC的luxS的缺失株。AI一2活性检测结果显示，luxS的缺失株丧失产生信号分子AI．2的能力。樱桃谷鸭半数致死量检测结果显示，luxS基因的敲除