禽致病性大肠杆菌phopq基因缺失对其致病性的影响

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1、分类号．０３６４：民３７８２＋１单位代码：１密级：学号：１２７２０２３３会傲４犬＃学位论文禽致病性大肠杆菌基因缺失对其致病性的影响Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ化６ｍｕｔａｎｔｏｎ化ｅａ化ｏｅｎｉｃｋｏｆＡｖｉａｎｐｇｙａｔｈｏｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｇ研究生；蒂博言指导教师：祁巧宗教授申请学位口类级别：农学硕女专业名称：基础兽医学研％方向：动物疫病病理与生物防治所

2、在学院；动物科技举院答辩委员会主席；二零一五年六月AnhuiAgriculturalUniversityMasterDissertationTheeffectofthephoP/QmutantonthepathogenicityofAvianpathogenicEscherichiacoliCandudate:HuangBo-yanSupervisor:Professor.QIKe-zongAcademicDegreeappliedfor:MasterofAgricultur

3、eMajor:BasicVeterinaryScienceDirection:AnimalPathologyandBiologicalControlCollege:AcademyofAnimalScienceandTechnologyJune2015国家自然科学基金资助项目《PhoP/Q对APEC关键毒力因子及β-防御素抗感染的调控研究》项目编号31372402摘要禽致病性大肠杆菌（AvianPathogenicEscherichiacoli,APEC）是严重危害禽类健康和养殖业发展的重要病原菌

4、。而PhoP/Q二元调控系统是一种广泛存在于禽致病性大肠杆菌中调控细菌毒力和许多细胞活性的信号传导调控系统，有关研究表明APEC致病过程中PhoP/Q二元调控系统在调控细菌致病力方面发挥着重要作用。但目前关于禽致病性大肠杆菌中PhoP/Q二元调控系统的调控的靶基因位点未见详细报道。本研究通过构建禽致病性大肠杆菌的phoP和phoQ基因缺失株和回复株，从野生株和基因缺失株之间毒力因子的转录水平、对细胞和鸡体致病力的比较，了解PhoP/Q二元调控系统与APEC致病力之间的关系。为后续明确PhoP/Q

5、二元调控系统对APEC毒力的调控机制奠定一些研究基础。具体研究内容和结果如下：1、禽致病性大肠杆菌phoP/Q基因缺失株及回复株的构建为探讨禽致病性大肠杆菌的PhoP/Q二元调控系统对细菌的调控作用，本实验通过从临床分离的29株禽致病性大肠杆菌中筛选出含有phoP基因和phoQ基因并对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，最终筛选出一株目的菌株AE17。采用Red同源重组的方法对目的菌株的phoP基因和phoQ基因内部功能区进行基因缺失，成功构建两株单基因缺失株（AE18和AE19）和一株双基因缺失株（

6、AE20）。对三株基因缺失株使用低拷贝质粒PSTV-28进行基因回复，根据生物信息学软件分析和相关文献显示phoP基因和phoQ基因共用一个启动子，所以phoQ缺失株和双基因缺失株构建相同的基因回复片段。将含有启动子的基因回复片段酶切回收后连接到已经酶切的低拷贝质粒PSTV-28上，回收构建好的载体转入相应的基因缺失株内，成功构建基因回复菌株CAE18、CAE19和CAE20。2、phoP/Q基因缺失对APEC生物学特性及毒力的影响比较构建成功的基因缺失株和基因回复株与野生株毒力基因的转录水平和

7、生化特性的变化。本实验通过生长曲线的测定、生化发酵实验、运动性能力的检测和Real-timePCR检测毒力基因的转录水平四方面探索PhoP/Q二元调控系统的基因缺失对APEC生长特性和毒力的影响。生长曲线测定结果显示，基因缺失株和回复株在LB液体培养基中的生长性能较野生株未发生明显改变。生化发酵实验鉴定结果显示缺失株和回复株的11种肠杆菌科生化特性与野生株结果一致，表明基因的缺失对APEC生化特性不会造成影响。运动性能力的检测结果表明phoP和phoQ基因的缺失能显著降低AE17的运动性能力。R

8、eal-timePCR结果显示，禽致病性大肠杆菌基因缺失株较野生株中MarA、metJ、ibeA、sodA、iss、ompA和fimC等13个毒力基因转录水平呈现不同程度的上调或下调。I3、phoP/Q基因缺失对细胞和鸡体致病力的影响Real-timePCR结果显示PhoP/Q二元调控系统可以调控APEC中毒力因子的转录和表达，影响细菌的致病力。本实验通过对CEF细胞黏附和入侵能力的比较、LD50的测定和动物病理组织切片的观察三方面探索了PhoP/Q二元调控系统对APEC致病力的影响。对鸡胚成纤