穿心莲内酯调控鸡致病性大肠杆菌群体感应系统的机制研究

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1、穿心莲内酯调控鸡致病性大肠杆菌群体感应系统的机制研究StudyonthemechanismofAndrographolideinterferingquorumsensingofavianpathogenicEscherichiacoli作者姓名：郭勋专业名称：临床兽医学指导教师：付本懂副教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年6月5日中文摘要穿心莲内酯调控鸡致病性大肠杆菌群体感应系统的机制研究鸡大肠杆菌病是由鸡致病性大肠杆菌（AvianpathogenicEscherichiacoli，APEC）引起的一种局部或全身性疾病，一年四季均可爆发，可导致败血症

2、、气囊炎、输卵管炎、蜂窝织炎等多种症状。APEC含有171个血清型，其中O78是亚洲最常见血清型之一。APEC含有许多毒力因子，包括摄铁螯合蛋白D（IucD），铁调节蛋白2（Irp-2），1型菌毛A（FimA），1型菌毛C（FimC），P型菌毛C（PapC），温度敏感血凝素(Tsh)，溶血素E（HlyE），血清存活因子（Iss），外膜蛋白A（OmpA）以及自转运空泡毒素（Vat）等。这些毒力因子与细菌铁摄取、代谢、黏附和侵入以及血清生存有关，而且这些毒力因子的表达可能与群体感应（Quorumsensing，QS）的调控密切相关。APEC感染开始于上呼吸道，

3、通过破坏气-血屏障进入血液循环而到达全身，最终导致败血症的产生。其中鸡肺II型上皮细胞在维持气-血屏障功能方面具有重要的作用，是APEC突破气-血屏障的关键环节。穿心莲内酯（Andrographolide）是穿心莲的主要活性成分之一，具有抗炎、抗菌和抗病毒活性。此外，穿心莲内酯对绿脓杆菌QS系统具有抑制活性。因此，本研究我们主要探讨在鸡致病性大肠杆菌O78（APEC-O78）造成鸡肺II型上皮细胞损伤过程中，QS系统的自诱导信号分子2（autoinducer-2，AI-2）所发挥的作用；并初步分析穿心莲内酯是否能够通过干扰APEC-O78的QS系统抑制AP

4、EC-O78对鸡肺II型上皮细胞的损伤作用。首先，通过收集APEC-O78上清，并与的哈维弧菌BB170（VibrioharveyiBB170，V.harveyiBB170）共培养，检测V.harveyiBB170发光间接检测AI-2的含量。结果发现，鸡致病性大肠杆菌APEC-O78具有分泌AI-2的能力，发光量与接种的APEC-O78上清量及共培养时间具有正相关性。APEC-O78分泌AI-2的量随其生长曲线发生改变，对数期AI-2分泌迅速上升，对数末期达到最大，但进入平台期后，AI-2分泌量迅速下降，直至衰亡期。在鸡致病性大肠杆菌黏附鸡肺II型上皮细胞

5、的模型基础上，我们采用乳酸脱氢酶活性（Lactatedehydrogenase，LDH）检测法、台盼蓝拒染实验、涂板法、IRT-PCR法等，研究APEC-O78能造成鸡肺II型上皮细胞损伤过程中，QS系统79的AI-2所发挥的作用。结果发现，APEC-O78（10-10CFU/mL）均能诱导鸡肺798II型上皮细胞损伤，且与接种10和10CFU/mLAPEC-O78组相比较，10CFU/mL组APEC-O78能造成鸡肺II型上皮细胞更严重的损伤。细胞毒性实验和台盼蓝拒染实验结果表明APEC-O78引起的细胞损伤具有细菌密度依赖性。随87后的RT-PCR研究

6、结果也表明，与接种10CFU/mLAPEC-O78相比较，109CFU/mLAPEC-O78组和10CFU/mLAPEC-O78组中APEC-O78毒力基因分泌显著降低。以上结果表明APEC-O78诱导鸡肺II型上皮细胞形态学损伤及细胞死亡率，LDH释放，APEC-O78毒力基因mRNA的表达均与AI-2的释放量呈正相关性。为了分析穿心莲内酯能否通过干扰APEC-O78的QS系统抑制APEC-O78对鸡肺II型上皮细胞的损伤作用，我们采用电镜、激光共聚焦等方法进行了检测。结果表明，低于最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentratio

7、n，MIC）的穿心莲内酯能够显著降低APEC-O78诱导鸡肺II型上皮细胞LDH释放（P<0.05），F-actin骨架重排，显著降低APEC对鸡肺II型上皮细胞的粘附率（P<0.05）。我们还发现，穿心莲内酯（10μg/mL）能显著降低APEC-O78AI-2的分泌（P<0.05）。此外，鸡肺II型上皮细胞形态学损伤、细胞超微结构损伤，细胞死亡率，APEC-O78毒力基因mRNA的表达均与穿心莲内酯（10μg/mL）抑制APEC-O78AI-2释放的结果一致。综上所述，AI-2作为APEC-O78的QS关键调节因子，在APEC-O78诱导鸡肺II型上皮细

8、胞损害过程中发挥着重要作用。而穿心莲内酯可能够作为APEC-O78