布鲁氏菌tir结构域蛋白tcpb影响tlr通路的分子机制研究

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1、布鲁氏菌TIR结构域蛋白TcpB影响TLR通路的分子机制研究ThemolecularmechanismofToll/IL-1receptor-likedomaincontainingproteinofBrucella(TcpB)’seffectiononTLR作者姓名：李文娜专业名称：劳动卫生与环境卫生学指导教师：李娟教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年05月27日摘要布鲁氏菌TIR结构域蛋白TcpB影响TLR通路的分子机制研究布鲁氏菌病(简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种在全球范围内广泛流行的人畜共患传染病。布鲁氏菌在宿主细胞

2、内的生存和复制引起的慢性感染是其主要毒力特征。布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)是一种能够分泌细菌毒力因子的多蛋白复合物，它可以将布鲁氏菌蛋白(又叫效应子)转移到宿主细胞，这些效应子对于易感宿主细胞内布鲁氏菌的生存和繁殖至关重要。布鲁氏菌TIR结构域蛋白(TcpB)是T4SS底物之一，它能够以多种方式破坏宿主的天然免疫应答，其中一种重要的方式是通过其所包含的生长素受体(TIR)结构域竞争性抑制Toll样受体(TLRs)与下游接头蛋白TIR结合，然而TcpB通过TIR结构域影响宿主天然免疫应答的机制目前尚不清楚。本研究设计和合成了Tcp

3、BTIR结构域表面不同区域位置的13个短肽，探讨这些短肽对脂多糖(LPS)诱导的TLR4信号的影响。首先分别从mRNA、蛋白质水平体外实验和体内实验对短肽处理后的细胞因子进行检测，从而找到对TLR4介导的细胞因子具有显著抑制作用的短肽，发现重要的分子结构。其次检测短肽对TLR4介导的NF-κB信号通路活性的影响，并从细胞整体水平对短肽的细胞毒性进行检测，从而为进一步了解TcpB的作用机制提供依据。1TcpB短肽对细胞因子表达和分泌的影响本研究以RAW264.7细胞和C57BL/6J小鼠为模型，将短肽分子孵育细胞或小鼠腹腔注射后，检测

4、细胞因子mRNA和蛋白质在脂多糖(LPS)诱导的炎症模型中的表达水平，评价TcpB短肽对细胞因子表达和分泌的影响。mRNA水平检测结果显示，LPS刺激80min后，阴性对照组与空白对照组相比细胞所有检测细胞因子的mRNA表达明显升高，短肽TF-8,9处理后实验组细胞较阴性对照组细胞MyD88依赖细胞因子(TNF-α、IL-6)和非依赖细胞因子(IFN-γ)mRNA的表达均出现显著的抑制作用；蛋白质水平体外实验检测结果显示，LPS刺激后，阴性对照组与空白对照组相比，细胞因子的分泌均显著增加，ITF8处理后这种增加均得到明显抑制，TF9

5、对IL-1和IFN-γ也出现明显的抑制，但其抑制作用不如TF8明显；蛋白质水平体内实验检测结果显示LPS刺激后，阴性对照组与空白对照组相比，小鼠血清中细胞因子表达显著增加，TF8,9实验组小鼠血清中TNF-α、IFN-γ的分泌较阴性对照组均出现明显抑制作用，且TF8的抑制作用强于TF9。结果表明，TIR结构区域中DD,αD,DE,βE在其免疫抑制过程中发挥重要作用，尤其是DDloop，即便单独出现也能起到抑制细胞因子分泌的作用，且这种抑制是通过MyD88依赖和MyD88非依赖两种途径。2TcpB短肽对NF-κB信号通路活性的影响本研

6、究用短肽分子孵育细胞后，westernblot法检测细胞内I-κB在LPS诱导的炎症模型中的表达水平变化，评估TcpB短肽对NF-κB信号通路的活性影响。结果显示，阴性对照组细胞与空白对照组相比I-κB的表达明显减少，这是由于NF-κB信号通路的激活导致的I-κB磷酸化而降解引起的，短肽TF2,3,4,5,8,9,10,11,12,13实验组细胞较阴性对照组I-κB表达明显增加，说明这些短肽能够抑制NF-κB信号通路激活。3TcpB短肽的细胞毒性采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测短肽对细胞的毒性。结果显示，实验组TF1,5,7,8较

7、阴性对照组有明显的细胞毒性，但是对照短肽TF0也出现细胞毒性，且与TF1,5,7,8无统计学差异。推测短肽分子的这种细胞毒性可能是由于其作为一种小分子蛋白干扰细胞内特定的细胞代谢而引起的，TcpB蛋白所表现出的细胞毒性可能与TcpB氨基酸序列翻译后的折叠、修饰等有关，单独的某一段结构区域并不能够表现出细胞毒性。综上所述，短肽TF8和TF9能够通过MyD88依赖和MyD88非依赖两种途径引起TLR4介导的细胞因子分泌减少，短肽TF2,3,4,5,8,9,10,11,12,13对NF-κB信号通路活性均表现出明显抑制作用，短肽TF0,1

8、,5,7,8能够明显降低细胞存活率。通过本研究，发现TcpB主要通过分子结构中的DDloop、αD、DE、βE发挥对TLR4通路干扰作用的，为进一步阐明TcpB的作用机制提供了依据。关键词:TcpB，布鲁氏菌，效应子，TLR4IIAb