肝癌相关蛋白HX1在TNFα信号通路中的功能和分子机制研究

《肝癌相关蛋白HX1在TNFα信号通路中的功能和分子机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、密级：中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences博士学位论文肝癌相关蛋白HXl在TNF．伐信号通路中的功能和分子机制研究2013年3月I删坩矬Y2431028ThefunctionandmolecularmechanismofmolecUlarHXl。i。n0n上IXTNF-asignalingpathwayByShiyouWangADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofD

2、octorofBiochemistryandMolecularBiologyInstituteofBiochemistryandCellBiology,ShanghaiInstituteforBiologicalSciences，ChineseAcademyofSciencesMarch，2013谨以此博士学位论文献给我亲爱的父母我挚爱的妻子我尊敬的导师和关心支持我的亲人朋友摘要肝癌相关蛋白HXl在TNF．仅信号通路中的功能和分子机制研究HXl最初是我们实验室从人正常肝的cDNA文库中克隆得到的一个肝癌相关基因。我们前期的研究工作表明HXl在正常肝组织中表达量较高，而在肝癌组织中的表达明显下调

3、；抑制肝癌细胞BEL．7404中HXl的表达可以促进细胞的生长与侵袭能力。后有文献报导HXl参与了细胞的内吞后分选过程，是内吞分选复合物I(EndosomalsortingcomplexrequiredfortransportI，ESCRT-I)的成员之一。然而，有关HXl在细胞中的生物学功能和作用机制并不是很清楚。HXl相互作用蛋白的鉴定。为了进一步研究HXl的功能，我们通过串联亲和纯化(TandemAffinityPurification，TAP)与质谱相结合技术找寻HXl相互作用蛋白，得到21个有对应NCBI基因收录号的候选蛋白，其中包括靶蛋白HXl，以及2个已知的HXl相互作用蛋白TS

4、Gl01和VPS28。随后，我们通过免疫共沉淀实验验证了部分候选蛋白，发现TNF．a信号通路上游complexI复合物中的一个重要成员RIPl与HXl有结合，提示我们HXl有可能参与调节TNF．0【信号通路。HXl参与调节TNF．n信号通路的活化。在Hela细胞中，我们通过逆转录病毒载体介导的shRNA构建了HXl蛋白表达下调的细胞模型，然后检测对TNF．a信号通路的影响。我们发现，HXl的下调表达可以抑制TNF一0【诱导的NF—rd3活化；HXl特异性的参与调节TNF．a诱导的细胞调亡，HXl的下调表达会使细胞对TNF．0【诱导的调亡更敏感，而对Fas．L诱导的细胞调亡没有影响；此外，HXl

5、的下调表达还可以减弱n师一a诱导的JNK以及p38的磷酸化。说明HXl对于TNF．a诱导的NF．rd3活化及JNK、p38的磷酸化具有促进作用，而对TNF．0【诱导的细胞调亡具有抑制作用。上述结果证明HXl在TNF．0【信号通路中扮演了十分重要的角色。I-IXl与TNF-a信号通路上游complexI复合物相互作用。我们通过反向免疫共沉淀和内源免疫共沉淀实验再次证明了HXl与RIPl的相互作用，并发现摘要HXl也可以与complexI复合物中另外两个成员TRAF2及TRADD相互结合。通过构建不同的缺失突变体，我们发现HXl的N端和C端均可与RIPl结合，而与TRADD、TRAF2的结合则依赖

6、HXl的C端；TRADD依赖其N端与HXl结合，而RIPl则通过其中间结构域结合HXl，这提示我们HXl的存在可以增强TRADD与RIPl之间的结合。通过构建的HXl蛋白表达下调的细胞模型，我们证实了这一想法。我们发现在TNF．0c诱导下，降低HXl的表达可以减弱TRADD对RIPl的募集作用，并且RIPl的多泛素化修饰水平也会明显降低，同时RIPl多泛素化下游IKKot／13的活化也受到抑制，表明HXl对RIPl的多泛素化修饰是必需的。此外，我们还发现，无论是外源过表达的TRAF2，还是内源性TRAF2的蛋白水平，在HXl低表达细胞中的含量较对照细胞中都有显著降低，并且随着TNF．a／CHX

7、的诱导，这种差异更加明显。通过加入不同类型的蛋白降解抑制剂，我们发现下调HXl的表达可促使TRAF2通过蛋白酶体途径进行降解。以上这些结果表明，HXl通过与TRADD及RIPl的结合，加强了TRADD与RIPl的结合能力，从而提高TRADD招募RIPl的效率；另外，HXl通过与TRAF2的结合，可以稳定TRAF2蛋白不被蛋白酶体降解，从而稳定整个complexI复合物。上述结果证明HXl通过与TN