大叶紫珠总黄酮抗氧化活性及抗鱼藤酮诱导的sh-sy5y细胞损伤机制的研究

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1、ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterinEngineeringMedicineAntioxidantActivityofTotalFlavonoidsfromCallicarpaMacrophyllaandItsMechanismsofProtectiveEffectonRotenone-inducedApoptosisinhumanneuroblastomasSH-SY5YcellsMaster

2、Candidate：LiuXiaoyingMajor：BiologySupervisor：Prof.XiaminHuWuhanUniversityofScienceandTechnologyWuhan,Hubei430081,P.R.ChinaMay20，2015摘要目的：探讨大叶紫珠总黄酮（TotalFlavonoidsfromCallicarpamacrophylla，TFCM）体外抗氧化活性以及对鱼藤酮（Rotenone，Rot）诱导的SH-SY5Y细胞损伤的机制。方法：1.TFCM含量测定及体外抗氧化活性评价

3、：（1）用NaNO2––Al(NO3)3–NaOH法测定TFCM含量。（2）以维生素C、BHT为对照，测定还原力，清除DPPH自由基、·OH自由基、O2-自由基及H2O2的能力来评估体外抗氧化能力。2.TFCM对鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响：将SH-SY5Y细胞分为正常组，模型组，TFCM低、中、高剂量组，TFCM低、中、高剂量组分别给予30、60、90mg/L剂量TFCM处理细胞，24h后与模型组同样用终浓度为20μM鱼藤酮作用24小时。用MTT法测定细胞存活率，TUNEL法检测细胞凋亡率。3.TFCM对

4、鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞损伤相关基因表达及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响：将SH-SY5Y细胞分为正常组，模型组，TFCM低、中、高剂量组，TFCM低、中、高剂量组分别给予30、60、90mg/L剂量TFCM处理细胞，24h后与模型组同样用终浓度为20μM鱼藤酮作用24小时。黄嘌呤氧化酶法（羟胺法）测细胞中SOD活力，硫代巴比妥酸法（TBA）测细胞中MDA含量，定量分析降低的谷胱甘肽与氧化的谷胱甘肽的比值来测定GSH-Px的活力，免疫荧光法及WesternBlot法检测凋亡相关基因Mcl-2、Clea

5、vedcaspase-3的表达。结果：1.（1）以芦丁作为标准对照，采用NaNO2––Al(NO3)3–NaOH法测得TFCM含量为81.19%。（2）体外抗氧化结果表明，在还原力测定试验中，还原力强弱顺序为TFCM

6、：不同剂量鱼藤酮作用SH-SY5Y细胞24h后，MTT法测细胞存活率，显示1μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM处理组的细胞存活率分别为（75.20±4.29）%、（67.20±8.43）%、（63.40±8.15）%、（58.30±5.94）%、(50.50±5.85)%、(39.00±2.69)%，与正I常组相比，细胞存活率显著降低，具有统计学差异（P<0.01），故选择终浓度20μM鱼藤酮处理构建SH-SY5Y细胞损伤模型。将SH-SY5Y细胞给予TFCM（60、90mg/L）处理24h后，用终

7、浓度为20μM鱼藤酮作用24h，MTT法检测细胞存活率结果显示，TFCM给药组(60、90mg/L)与模型组比较，其存活率明显增高，且有剂量依赖性（P<0.05）；TUNEL法检测结果显示模型组TUNEL阳性细胞较多，凋亡率为（61.8±6.0）%，TFCM给药组（60、90mg/L）凋亡率分别为（28.2±8.0）%、（16.7±6.0）%，与模型组比较凋亡率显著降低（P<0.01），且均呈剂量依赖性。3.SOD、GSH-Px活性和MDA含量检测结果显示：与正常组比较，模型组SOD、GSH-PX活性明显降低，MDA

8、含量明显上升，具有统计学意义（P<0.01）；TFCM给药组（60、90mg/L）与模型组比较，SOD、GSH-Px活性明显升高，MDA含量明显下降(P<0.01或P<0.05)，呈剂量依赖性。WesternBlot法检测显示，与正常组比较，模型组Mcl-1蛋白表达明显下降，Cleavedcaspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01），