多巴胺d2受体-cx43信号通路调控镜像痛敏的分子与细胞机制

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1、分类号：Q257单位代码：10719学号：12113001密级：论文题目：多巴胺D2受体‐Cx43信号通路调控镜像痛敏的分子与细胞机制论文作者：宋雨田指导教师、职称：刘霞副教授学科、专业名称：细胞生物学提交论文日期：二〇一五年六月创新性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢中所罗列的内容以外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果；也不包含为获得延安大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究

2、所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。本人签名：日期：关于论文使用授权的说明本人完全了解延安大学有关保留和使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属延安大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为延安大学。学校有权保留送交论文的复印件，允许查阅和借阅论文；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。（保密的论文在解密后遵守此规定）本学位论文属于保

3、密在年解密后适用本授权书。本人签名：日期：导师签名：日期：多巴胺D2受体-Cx43信号通路调控镜像痛敏的分子与细胞机制细胞生物学宋雨田指导老师刘霞副教授摘要:疼痛是当前严重困扰人类健康的生物医学难题之一，已被广泛认同为“一种疾病”。疼痛诱发因素和表症多样化，除在躯体损伤部位表现持续自发痛、原发性痛敏和损伤部位周围区域出现继发性痛敏外，在损伤部位同体节的对侧对称部位亦出现所谓“镜像痛敏”。疼痛所呈现的持续性、慢性化、个性化在多层面制约着临床预防、诊断、治疗策略的有效选择。近年来，尽管相关疼痛调控机制研

4、究和医学转化发展迅猛、高潮迭起，但仍缺乏对诸如镜像痛敏等复杂表症发生、发展和维持机制的系统理解。多方证据表明，多巴胺D2受体（DRD2）、缝隙连接胞间通讯、神经胶质细胞均可通过不同途径参与疼痛调控，但有关其互作机制尚待阐明。本文拟基于前期模拟蝎蛰致痛的自然临床现象而构建的实验性镜像痛敏动物模型，经大鼠足底皮下注射东亚钳蝎蝎毒主要成分——蝎毒素多肽类特异性钠通道调制剂BmKI，采用行为学、实时定量PCR、免疫印迹和免疫荧光等实验技术，探索外周和中枢DRD2、连接蛋白Connexin43（Cx43）、神

5、经胶质细胞与镜像痛敏发生、发展和维持的相关性，构建DRD2-Cx43信号通路调控镜像痛敏分子与细胞机制的创新知识体系。主要结果如下：（1）DRD2阻断剂与缝隙连接抑制剂协同抑制BmKI诱发疼的痛行为：经大鼠单侧足底皮下注射BmKI，可诱发持续的自发痛、注射同侧的热痛敏和镜像机械痛敏。单独预先鞘内注射DRD2阻断剂雷氯必利或缝隙连接解抑制剂Carbenoxolone(CBX)均可显著抑制BmKI诱致的自发痛和镜像机械痛敏；同时注射雷氯必利与CBX呈现显著的协同抑制作用。相反，单独给予DRD2激动剂Qu

6、inelorane则增强BmKI诱发的自发痛，呈现致痛效应。这些结果表明，脊髓和背根神经节DRD2与connexins均参与了镜像痛敏发生、发展和维持的调控，且二者具有密切的表达分布和细胞信号通路联系。（2）脊髓DRD2与Cx43差异表达与镜像痛敏的相关性：免疫荧光表明，DRD2I与Cx43主要共标于脊髓深层，随疼痛的发展逐渐向外侧迁移；RT-PCR结果显示，鞘内给药雷氯必利使对侧DRD2mRNA整体下调。相比对照组，给药组对侧Cx43mRNA上调。同时，免疫印迹结果显示，刺激同侧DRD2蛋白水平先

7、升后降，幅度较小，对侧则在24h突然升高。雷氯必利可显著逆转同侧的上调，增强对侧上调趋势；此外，雷氯必利组，Cx43蛋白水平随时程逐渐上调，而对侧呈现下调趋势；给药组双侧GFAP蛋白水平均下调；双侧Iba1蛋白水平也被明显下调。同时，免疫荧光显示，DRD2与Cx43共标，在星形胶质细胞和小胶质细胞中也有明显表达。结果表明，脊髓DRD2与Cx43的双侧差异表达与镜像痛敏的发生、发展和维持密切相关，而调控Cx43的开放和蛋白表达变化是DRD2参与镜像痛敏的重要机制之一。（3）背根神经节DRD2与Cx43

8、差异表达与镜像痛敏的相关性：RT-PCR结果显示，与BmKI组相比，给药组DRD2mRNA水平整体下调，而对侧上调。与对照组相比，给药组的注射侧Cx43mRNA水平先降后升，对侧则在8h处升高。免疫荧光结果显示，DRD2与Cx43共标，且在卫星胶质细胞、小胶质细胞中大量表达。给药组注射侧DRD2和Cx43共标量上调；双侧DRD2和卫星胶质细胞共标量均下调；DRD2和小胶质细胞共标量上调，呈现先增后降趋势。另外DRD2与大直径神经元大量共标，而与非肽能神经元共标较少。这