多巴胺d_2样受体激动对多巴胺能细胞自噬的调控及其机制研究

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1、SOOCHOWUNIVERSITY硕士学位论文论文题目多巴胺02样受体激动对多巴胺能细胞自噬的调控及其机制研究研究生姓名王健达指导教师姓名刘春风胡丽芳专业名称神经病学研究方向帕金森病论文提交日期2015年3月2多巴胺D2样受体激动对多巴胺能细胞自噬的调控及其机制研究中文摘要中文摘要目的：研究多巴胺D2样受体激动剂对多巴胺能细胞自噬水平和α-synuclein等易聚集蛋白降解的调控及其分子机制。方法：离体实验以多种多巴胺能细胞株如PC12、MES23.5、SH-SY5Y和原代培养的大鼠中脑神经元为工具细胞，其中PC12细胞为主要研究对象；以多巴

2、胺受体激动剂普拉克索和喹吡罗，以及多巴胺D2、D3受体特异性拮抗剂为工具药;WesternBlot检测各种蛋白的表达或磷酸化水平的变化；用维甲酸(RA)联合佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(TPA)诱导SH-SY5Y细胞分化；普通和定量PCR检测不同细胞内D2样受体和BECN1的mRNA水平变化；CCK-8检测细胞活力,以cleavedcaspase-3蛋白表达水平变化评价细胞凋亡情况；激光共聚焦观察细胞内EGFP-LC3、GFP-RFP-LC3点状聚集和多巴胺D2、D3亚型受体的定位和分布情况；透射电镜观察细胞内自噬小体的形成情况；钙成像

3、仪动态监测细胞内游离钙离子水平；瞬时转染技术干扰和过表达Beclin1以及c-Fos；免疫共沉淀（Co-IP）观察Beclin1和PtdIns3K蛋白相互作用情况；染色质免疫共沉淀（ChIP）观察c-Fos蛋白和BECN1启动子的结合情况；荧光素酶双标实验检测BECN1启动子的活性；以携带WT和A53T、A30P突变型SNCA的慢病毒感染PC12细胞诱导α-synuclein过表达；以携带Htt-552-18Q、Htt-552-100Q的腺病毒感染PC12细胞诱导Htt-552蛋白过表达。在体以15月龄的野生型和A53T-SNCA转基因小鼠为

4、研究对象；以腹腔注射0.5mg/kg的普拉克索，每天注射两次，持续3周给药，用等体积的生理盐水作为阴性对照组。3周后，分离黑质和纹状体组织，用常规westernblotting检测各蛋白的表达变化。结果：1.多巴胺细胞中多巴胺D2样受体的表达情况：PC12细胞主要表达多巴胺D2受体，MES23.5细胞上同时表达多巴胺D2及D3受体，低分化的SH-SY5Y细胞上很少表达多巴胺D2受体，D3受体几乎不表达，RA/TPA诱导SH-SY5Y细胞分化后多巴胺D2受体表达有所增加，D3受体则明显增加。2.D2样受体激动剂对细胞自噬水平及存活的影响：1）与

5、对照组相比，多巴胺D2样受体激动剂普拉克索在一定剂量范围内（10-100μM）呈浓度和时间依赖性地I中文摘要多巴胺D2样受体激动对多巴胺能细胞自噬的调控及其机制研究促使PC12、MES23.5和诱导分化的SH-SY5Y细胞内LC3-II和Beclin1蛋白表达增加、而P62蛋白水平明显下降；喹吡罗（另一个经典的多巴胺D2样受体激动剂）作用于PC12细胞后也观察到类似的现象；而普拉克索右旋对映体（几乎无多巴胺D2样受体激动活性）作用于PC12细胞未观察到上述蛋白水平的变化。普拉克索（100μM）作用于未分化的SH-SY5Y（多巴胺D2样受体表达

6、较低）也未观察到上述蛋白水平的变化；巴弗洛霉素A1(抑制自噬体和溶酶体融合)和氯喹（抑制溶酶体酶活性）存在时，普拉克索和喹吡罗仍然可以增加LC3-II水平；上述两个多巴胺D2样受体激动剂作用于PC12细胞后，LAMP1和LAMP2蛋白水平均无变化。2）免疫荧光观察到普拉克索作用的PC12细胞内EGFP-LC3点状聚集明显增加，转染RFP-GFP-LC3的PC12细胞内GFP、RFP点状聚集均显著增加，而且RFP点状聚集增加更为明显；3）原代培养的大鼠中脑神经元中，普拉克索作用后LC3荧光点状聚集明显增多；4）透射电镜观察到普拉克索及喹吡罗处理

7、12h后PC12细胞内自噬小体形成明显增多；5）特异性多巴胺D2，D3受体抑制剂存在时，普拉克索不能促使多巴胺能细胞中上述自噬相关蛋白水平改变。6）在上述研究使用的剂量范围内（普拉克索不高于100μM、喹吡罗不高于10μM），这些D2样受体激动剂作用24h,PC12细胞活力并没有明显变化，也未发生明显凋亡。上述结果充分表明，以普拉克索为代表的多巴胺D2样受体激动剂可以诱导并增加多巴胺细胞内的自噬水平，且在一定浓度范围内对多巴胺能细胞活力没有明显影响。3.相关机制研究结果：普拉克索作用于PC12细胞后引起：1）c-Fos蛋白表达随时间依赖性增加

8、；2）p-CaMKIV(Thr196)和p-CREB(S133)的磷酸化水平明显增加；3）p-JNK(Thr183/Tyr185)和p-c-Jun(S63)的磷酸化